GloSensor™ Technology

Biosensore di luciferasi per la rilevazione in tempo reale di eventi di segnalazione

La tecnologia GloSensor™ fornisce una piattaforma di biosensori flessibili basati sulla luciferasi per il rilevamento in tempo reale di eventi di segnalazione in cellule vive con sensibilità, linearità e specificità.

La luciferasi GloSensor™ è permutata circolarmente, unendo i termini N e C del tipo selvaggio con un dominio polipeptidico o proteico e creando termini ingegnerizzati in altri punti della struttura. Il legame con l'analita o la scissione della proteasi porta a uno spostamento conformazionale del biosensore che promuove un forte aumento dell'attività di luminescenza. L'entità dell'aumento di luminescenza è direttamente proporzionale alla quantità di analita o di attività proteasica presente.

Protocollo semplice, scalabile e a cellule vive

GloMax Discover System Multimode Plate Reader

Il protocollo di saggio non litico a cellule vive è facile da eseguire e consente di monitorare l'attività del biosensore in modo continuo o in un singolo punto temporale. Il profilo cinetico degli eventi di segnalazione cellulare può essere seguito in tempo reale e i saggi possono essere facilmente adattati a formati di micropiastre ad alta densità, comprese le piastre a 96, 384 e 1536 pozzetti.

Le fasi del protocollo sono:

Pre-equilibrare le cellule con il reagente GloSensor™ cAMP per circa 2 ore.
Trattare con agonisti/antagonisti specifici o composti di libreria.
Misurare la luminescenza dopo 10-30 minuti in modo continuo o in un singolo punto temporale.

Qualsiasi luminometro con iniettori è sufficiente per leggere il saggio.

Eseguire saggi di cAMP, cGMP o proteasi

Monitor Intracellular cAMP in a Live-Cell Assay

Il saggio GloSensor™ cAMP può essere utilizzato per monitorare l'attivazione di recettori 7-TM accoppiati a proteine G (GPCR) endogeni o sovraespressi, insieme alle fosfodiesterasi (PDE) responsabili della degradazione del cAMP intracellulare. Le variazioni intracellulari della concentrazione di cAMP possono essere seguite utilizzando un formato di saggio non litico a cellule vive, che consente di monitorare in tempo reale le variazioni della concentrazione di cAMP.

Sono disponibili diversi biosensori da utilizzare nel saggio GloSensor™ cAMP. In ogni caso, un dominio di legame del cAMP è fuso con una forma circolarmente permutata di luciferasi a farfalla. La sequenza di ciascuno di essi differisce, dando vita a biosensori con una gamma di affinità per il cAMP. In generale, il plasmide pGloSensor™-22F cAMP è il più adatto per la maggior parte delle applicazioni, poiché offre una combinazione unica di sensibilità e gamma dinamica. Il costrutto 22F è sufficientemente sensibile per monitorare l'attività dell'agonista inverso o l'attivazione del recettore Gi-coupled in assenza di forskolina aggiunta, ma possiede un intervallo dinamico sufficientemente ampio per monitorare aumenti molto consistenti della concentrazione intracellulare di cAMP.

12766MA_600px — **Risposta cinetica del GloSensor™ cAMP rispetto a un immunodosaggio per cAMP.** Le cellule HEK293 che esprimono transitoriamente il plasmide cAMP pGloSensor™-22F sono state trattate in sequenza con 1µM di isoproterenolo (ISO), 10µM di propranololo (PRO) e 10µM di forskolina (FSK). Per monitorare i livelli di cAMP è stato utilizzato il protocollo GloSensor™ cAMP Assay in vivo, non litico, mentre i pozzetti replicati sono stati lisati a ogni punto temporale per il cAMP immunoassay (Enzo Life Sciences). I campioni superiori a circa 20nM hanno richiesto una diluizione affinché il test immunologico cAMP rientrasse nell'intervallo lineare della curva standard. (ISO = agonista ADRB2, PRO = antagonista ADRB2, FSK = attivatore dell'adenililciclasi permeabile alle cellule).

Monitor Intracellular cGMP in a Live-Cell Assay

Il test GloSensor™ cGMP è utilizzato per monitorare le variazioni della concentrazione intracellulare del secondo messaggero cGMP. Il saggio può essere utilizzato per monitorare l'attivazione delle guanililciclasi endogene o sovraespresse, comprese le isoforme della guanilciclasi solubile (sGC) o del recettore del peptide natriuretico atriale (NPRA e NPRB), insieme alle fosfodiesterasi (PDE) responsabili della degradazione del cGMP intracellulare. Le variazioni intracellulari della concentrazione di cGMP possono essere seguite utilizzando un formato di saggio non litico a cellule vive, che consente di monitorare in tempo reale le variazioni della concentrazione di cGMP.

Sono disponibili diversi biosensori da utilizzare nel saggio GloSensor™ cGMP. In ogni caso, un dominio legante il cGMP è fuso con una forma circolarmente permutata di luciferasi a farfalla. Il dominio di legame del cGMP e la sequenza differiscono, dando origine a biosensori con diverse affinità per il cGMP. In generale, il costrutto 40F è preferito quando si sovraesprime una guanililciclasi, in quanto fornisce la massima gamma dinamica ad alti livelli intracellulari di cGMP. Al contrario, il costrutto 42F è preferito quando si esegue il dosaggio di una guanililciclasi endogena, fornendo la massima sensibilità a livelli intracellulari più bassi di cGMP.

12767MA_600px — **Monitoraggio del cGMP in tempo reale.** Le cellule HEK293 che esprimono transitoriamente il costrutto 42F sono state trattate con dosi variabili di nitroprussiato di sodio (SNP), un donatore di ossido nitrico, per attivare la guanililciclasi solubile endogena (sGC). Per monitorare la risposta al cGMP in tempo reale è stato utilizzato il protocollo GloSensor™ cAMP Assay in vivo, non litico.

Luminescent Detection of Protease Activity

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GloSensor™ Plasmids

Offriamo due varianti del biosensore e consigliamo il plasmide pGloSensor™-22F cAMP come prima scelta per la maggior parte delle applicazioni.

Plasmide pGloSensor™-22F cAMP. In seguito all'espressione in vitro senza cellule, la versione codificata da questo costrutto mostra un aumento dell'_EC50 per l'attivazione e del rapporto segnale-sfondo alla saturazione del cAMP rispetto alla versione codificata dal costrutto pGloSensor™-20F cAMP. In generale, abbiamo osservato relazioni simili tra i due costrutti quando le loro prestazioni sono state confrontate in cellule viventi.

Plasmide pGloSensor™-20F cAMP. La versione codificata da questo costrutto si comporta bene in cellule HEK293 a 37°C. La luminescenza del costrutto pGloSensor™-22F cAMP Plasmid può essere più difficile da rilevare a temperature fisiologiche.

Per una spiegazione approfondita delle differenze di prestazioni tra i due plasmidi, consultare la Sezione 3.B, Raccomandazioni sulla scelta del plasmide GloSensor™, nel Manuale tecnico #TM076 (fornito nella sezione Protocollo di seguito).

pGloSensor-22F cAMP Plasmid. — pGloSensor™-20F cAMP, Numero di Accessione EU770615; Sequenza (file .txt)
pGloSensor™-22F cAMP, numero di accesso GU174434; sequenza (file .txt)

Protocols

Complete Protocol

GloSensor™ cAMP Assay Technical ManualPDF (1631 KB) – English

Quick Protocols

GloSensor cAMP Assay Quick Protocol FB113PDF (286 KB) – English

What's in the box

Item	Part #	Choose a size
GloSensor™ cAMP Reagent	E129A	1 × 25mg

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What's in the box

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GloSensor™ cAMP Reagent	E129B	1 × 250mg

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pGloSensor™-22F cAMP Plasmid	E230A	1 × 20μg

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Patents and Disclaimers

BY USE OF THIS PRODUCT, RESEARCHER AGREES TO BE BOUND BY THE TERMS OF THIS LIMITED USE LABEL LICENSE. If researcher is not willing to accept the terms of this label license, and the product is unused, Promega will accept return of the unused product and provide researcher with a full refund.
Researchers may use this product in their own research solely for the luminescent determination of molecular binding, enzymatic activity or other functional activity. Researchers shall have no right to modify or otherwise create variations of the nucleotide sequence encoding the GloSensor™ technology of this product (i.e., the bioluminescent chimeric protein comprising luciferase and other functional domains). Researchers may transfer derivatives to others provided that recipients agree to be bound by the terms of this label license prior to such transfer. No other use or transfer of this product is authorized without the prior express written consent of Promega. In addition, researchers must either: (1) use GloSensor™ cAMP Reagent for in vitro and in cell applications, and VivoGlo™ Luciferin, In Vivo Grade, for animal applications for all determinations of luminescence activity of this product and derivatives; or (2) contact Promega to obtain a license for use of the product and derivatives in conjunction with luminescent assay reagents not purchased from Promega. PROMEGA MAKES NO REPRESENTATIONS OR WARRANTIES OF ANY KIND, EITHER EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING FOR MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE WITH REGARDS TO THE PRODUCT. The terms of this label license shall be governed under the laws of the State of Wisconsin, USA.

U.S. Pat. No. 7,728,118 and other patents pending.

What's in the box

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pGloSensor™-20F cAMP Plasmid	E117A	1 × 20μg

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GloSensor™ Technology

Part Numbers: E1290, E1291, E2301, E1171

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