Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay
A Bioluminescent Method to Directly Measure Inflammasome Activity
- Fast, simple, homogeneous caspase-1 assay kit
- Selective and quantitative
- Multiplex and high-throughput screening (HTS) compatible
Catalog Number:
Size
Catalog Number: G9951
Catalog Number: G9952
Catalog Number: G9953
Misura l'attività della caspasi-1 nelle cellule o nel terreno, senza necessità di preparare il campione
Il saggio Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay è un metodo semplice, omogeneo e bioluminescente per misurare selettivamente l'attività della caspasi-1, un componente essenziale dell'inflammasoma.
Gli inflammasomi sono complessi proteici indotti da diversi stimoli infiammatori. Le cellule immunitarie innate rispondono agli agenti patogeni e ad altri segnali di pericolo con la formazione dell'inflammasoma e la conversione dello zimogeno procaspasi-1 in caspasi-1 cataliticamente attiva. L'attivazione della caspasi-1 determina l'elaborazione e il rilascio delle citochine IL-1β e IL-18, nonché la piroptosi, una forma immunogena di morte cellulare. Il saggio Caspase-Glo® 1 è sufficientemente sensibile per misurare l'attività della caspasi-1 direttamente nelle cellule o nel terreno in piastre multipozzetto.
Come funziona
In seguito alla scissione della caspasi del substrato Z-WEHD (Z-WEHD-aminoluciferina), viene rilasciato un substrato per la luciferasi (aminoluciferina), con conseguente attività luciferasica e generazione di luce da parte di una luciferasi ricombinante termostabile di proprietà.
Semplice e veloce
Non è necessaria alcuna preparazione o manipolazione del campione. È sufficiente aggiungere, mescolare e misurare la luminescenza dopo solo un'ora. È possibile ottenere risultati più rapidamente e con meno passaggi rispetto alle analisi Western blot ed ELISA convenzionali. Il segnale luminescente stabile e il formato di grande volume (100 ml) supportano le applicazioni di screening ad alta produttività.
Selettivo e quantitativo
Il substrato selettivo della caspasi-1 (Z-WEHD) consente di rilevare la caspasi-1 cataliticamente attiva nelle cellule o nei terreni di coltura e di misurare quantitativamente l'attività dell'inflammasoma. L'inclusione dell'inibitore del proteasoma MG-132 nel reagente elimina il clivaggio aspecifico del substrato del proteasoma, consentendo una rilevazione sensibile della caspasi-1. Il test include un inibitore specifico della caspasi-1 (Ac-YVAD-CHO) per confermare l'attività specifica in campioni paralleli e distinguere l'attività della caspasi-1 dalle altre caspasi.
L'attività della caspasi-1 si distingue da quella di altre caspasi
Le caspasi dell'infiammazione e dell'apoptosi a concentrazioni equimolari sono state testate con il saggio, /– Ac-YVAD-CHO, e l'attività delle caspasi è stata misurata dopo 20 minuti. Ac-YVAD-CHO a 1µM ha inibito il 99% dell'attività della caspasi-1, mentre ha avuto un effetto minimo sulle altre caspasi cross-reagenti (5, 3 e 6).
L'inibitore della NLRP3 previene l'attivazione della caspasi-1 nelle cellule THP-1 e PBMC
L'NLRP3 svolge un ruolo chiave nel rilevamento immunitario avviando l'assemblaggio di un inflammasoma in risposta a vari segnali di pericolo. L'inflammasoma NLRP3 innesca l'attivazione della caspasi-1 e la secrezione della citochina IL-1β, provocando infine una morte cellulare infiammatoria e piroptotica. Il saggio Caspase-Glo® 1 consente di misurare facilmente l'effetto degli inibitori della NLRP3 sull'attivazione della caspasi-1 in cellule primarie.
Le cellule THP-1 sono state differenziate per 3 giorni con PMA. Il terreno è stato sostituito e aggiunto MCC950 (inibitore dell'inflammasoma NLRP3), seguito da LPS o veicolo. Metà del terreno di coltura (50µl) è stato rimosso dopo 3 ore di LPS e analizzato con il Reagente Caspasi-Glo® 1 o il Reagente Caspasi-Glo® 1 YVAD-CHO.
Le PBMC sono state piastrate, quindi trattate con MCC950 seguito da LPS o veicolo per una notte. Dopo il trattamento notturno, le cellule sono state trattate con nigericina o veicolo. La nigericina provoca un efflusso di potassio e una significativa attivazione della caspasi-1 dopo il priming con LPS. Metà del mezzo di coltura (50µl) è stato quindi rimosso e testato con il Reagente Caspase-Glo® 1 o il Reagente Caspase-Glo® 1 YVAD-CHO. La luminescenza è stata letta per entrambi dopo 1 ora. Il segnale di Caspase-Glo® 1 dimostra un'inibizione dose-dipendente dell'attività della caspasi-1 da parte dell'inibitore dell'inflammasoma NLRP3.
Attività della caspasi-1 rilevata nelle cellule mononucleari del sangue periferico e rilasciata nel mezzo di coltura
Il saggio Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay monitora l'attività della caspasi-1 nel surnatante delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Le cellule sono state stimolate con o senza LPS e successivamente stimolate con ATP per 30 minuti. Le cellule sono state poi pellettate e il surnatante è stato analizzato per l'attività della caspasi-1.
Multiplex con altri test basati sulle cellule
Il saggio Caspase-Glo® 1 è abbastanza sensibile da rilevare l'attività della caspasi-1 da un piccolo volume di terreno trasferito. Questo lascia le cellule intatte per altri test, come la vitalità cellulare o la citotossicità, in modo da ottenere più dati per campione.
Test Caspase-Glo® 1 Inflammasome Multiplexed con test di vitalità e morte cellulare. Le cellule THP-1 sono state coltivate in terreno RPMI 1640 integrato con 10BS in un incubatore a 37°C con 5 O2. Le cellule sono state aggiunte alle piastre a 5 x105 cellule/ml in 100µl di terreno e differenziate con PMA (20nM, 3 giorni) in piastre a 96 pozzetti, seguite da trattamento con flagellina (1µg/ml, 1 ora) o nigericina (20µM, 2 ore). Nel pannello A è stato aggiunto alle cellule il reagente CellTox™ Green, il reagente Caspase-Glo® 1 o il reagente Caspase-Glo® 1 YVAD-CHO e dopo 90 minuti è stata registrata la fluorescenza (CellTox™ Green) o la luminescenza (Caspase-Glo® 1). Nel pannello B la vitalità cellulare è stata monitorata con CellTiter-Glo® o RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay. La luminescenza è stata registrata rispettivamente a 10 e 90 minuti.
Featured Publications
Vedere altri dati:
Questo articolo, sottoposto a revisione paritaria, mostra come il saggio Caspase-Glo® 1 sia in grado di rilevare in modo specifico l'attività della caspasi-1 in cellule trattate con induttori dell'inflammasoma, di confermare i meccanismi di attivazione dell'inflammasoma a uno e due segnali e di monitorare l'attività della caspasi-1, la morte cellulare e il rilascio di IL-1β dallo stesso pozzetto di micropiastra.
This peer-reviewed study "Interrogating direct NLRP3 engagement and functional inflammasome inhibition using cellular assays" examines the direct engagement and functionality of NLRP3 pathway activity in cells using several mechanistic assays, including the Lumit® IL-1β Immunoassay and Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay.
Protocols
Complete Protocol
Specifications
Catalog Number:
What's in the box
| Item | Part # | Choose a size | Concentration |
|---|---|---|---|
|
MG-132 Inhibitor |
G932B | 2 × 30μl | |
Z-WEHD Substrate |
G991A | 1 × 1 bottle | |
Ac-YVAD-CHO |
G992A | 1 × 10μl | 2mM |
Caspase-Glo® 1 Buffer |
G994A | 1 × 10ml |
SDS
Search for SDSCertificate of Analysis
Use Restrictions
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.Storage Conditions
What's in the box
| Item | Part # | Choose a size | Concentration |
|---|---|---|---|
|
MG-132 Inhibitor |
G932C | 1 × 300μl | |
Z-WEHD Substrate |
G991A | 5 × 1 bottle | |
Ac-YVAD-CHO |
G992A | 5 × 10μl | 2mM |
Caspase-Glo® 1 Buffer |
G994A | 5 × 10ml |
SDS
Search for SDSCertificate of Analysis
Use Restrictions
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.Storage Conditions
What's in the box
| Item | Part # | Choose a size | Concentration |
|---|---|---|---|
Caspase-Glo® 1 Buffer |
G994B | 1 × 100ml | |
|
MG-132 Inhibitor |
G932C | 2 × 300μl | |
Z-WEHD Substrate |
G991B | 1 × 1 bottle | |
Ac-YVAD-CHO |
G992B | 1 × 100μl | 2mM |
SDS
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Use Restrictions
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.Storage Conditions
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