Dosaggi per il rilevamento di nucleotidi e cofattori
Il nicotinammide adenina dinucleotide (NAD) è un importante cofattore per la produzione di ATP durante la fosforilazione ossidativa. Il nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADP) è fondamentale per le vie biosintetiche di creazione delle macromolecole. Sia il NAD che il NADP forniscono equivalenti riducenti attraverso la conversione tra le forme ossidate (NAD , NADP ) e le forme ridotte (NADH, NADPH).
Il NAD ha un altro ruolo come substrato nelle reazioni di ribosilazione ADP coinvolte nella riparazione del DNA, nell'espressione genica, nella regolazione delle MAPK e nella segnalazione del Ca2.
Offriamo saggi sensibili basati sulla bioluminescenza per monitorare i livelli cellulari di NAD o NADPH ossidato, ridotto o totale attraverso una reazione enzimatica accoppiata. La reazione principale può essere utilizzata per monitorare il consumo o la produzione di NADH o NADPH in saggi biochimici e in vitro.
Nello studio del metabolismo, l'ATP è un elemento fondamentale. Promega offre i più sensibili test bioluminescenti add-mix-measure per la misurazione dell'ATP nei saggi basati sulle cellule.
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Introduzione ai dosaggi per il rilevamento di nucleotidi e cofattori
I nicotinammidi adenina dinucleotidi sono abbondanti cofattori solubili che subiscono ossidazione e riduzione reversibili nelle principali vie metaboliche. Sono importanti nella ricerca sul cancro perché, come metaboliti, possono collegare le vie metaboliche al controllo trascrizionale, all'epigenetica e alla segnalazione cellulare quando le cellule passano da un metabolismo normale a un metabolismo delle cellule cancerose (proliferativo). Nelle cellule sono presenti negli stati ossidato e ridotto come forme non fosforilate (NAD e NADH) e fosforilate (NADP e NADPH). Questi dinucleotidi lavorano in coppia e ogni coppia ha funzioni distinte.
NAD e NADH sono cofattori chiave nel metabolismo energetico. Nelle cellule a riposo, il rapporto tra NAD e NADH è sbilanciato verso una maggiore quantità di NAD. Le cellule in proliferazione tendono ad avere un eccesso di NADH. Il NADH viene generato durante la fosforilazione a livello del substrato nella via glicolitica e fornisce equivalenti riducenti per la produzione di ATP durante la fosforilazione ossidativa. ;
Il NAD è noto soprattutto per il suo ruolo nel metabolismo energetico, ma è anche utilizzato da enzimi come la poli ADP-ribosio polimerasi (PARP) e le sirtuine che eseguono reazioni di ribosilazione dell'ADP. Un'area di ricerca attiva è la sintesi de-novo di NAD dai sottoprodotti delle reazioni di ribosilazione dell'ADP. ;
Il NADP e il NADPH sono importanti soprattutto per fornire equivalenti riducenti per le reazioni biosintetiche e per la rigenerazione di due molecole di GSH dal GSSG. Il NADP e il NADPH sono difficili da misurare, poiché questa coppia è 10 volte meno abbondante della coppia NAD e NADH. Il ruolo di rigenerazione del GSH è fondamentale per controllare i livelli di ROS generati dalla fosforilazione ossidativa. ;
A causa dei diversi ruoli che i nicotinammide adenina dinucleotidi svolgono nella regolazione cellulare, nell'espressione genica e nelle malattie, i biologi stanno ora esaminando queste molecole come indicatori del meccanismo d'azione dei farmaci o della tossicità dei trattamenti e nella ricerca sulla scoperta di farmaci. ;
I ricercatori beneficiano di saggi per monitorare i livelli di questi nucleotidi e cofattori in saggi bioluminescenti sensibili che sono adatti a formati di screening ad alta produttività. I formati di analisi alternativi includono analisi colorimetriche o fluorimetriche basate su lettori di piastre meno sensibili, che richiedono un'ulteriore elaborazione del campione. Per monitorare i livelli di cofattori si possono utilizzare anche tecniche di chimica analitica come la spettrometria di massa.
