Cellule competenti
Per gli esperimenti di clonazione standard sono disponibili cellule competenti in due formati: alta efficienza con più di108 ufc/μg per il clonaggio (JM109, HB101) ed efficienza per il subclonaggio con più di107 ufc/μg (HB101). Le cellule JM109 hanno l'ulteriore caratteristica di effettuare uno screening blu/bianco dei ricombinanti.
Per l'espressione delle proteine si possono usare cellule competenti JM109(DE3), BL21(DE3) o KRX. Le cellule competenti a fase singola (KRX) sono progettate per una trasformazione efficiente e un'espressione proteica strettamente controllata. Queste cellule riuniscono i migliori attributi di queste due fasi in un unico ceppo per valutare l'espressione proteica in E. coli.
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Cosa sono le cellule competenti?
La trasformazione dei batteri con plasmidi è importante perché i batteri sono utilizzati come mezzo per conservare e replicare i plasmidi. Le cellule di E. coli hanno maggiori probabilità di incorporare DNA estraneo se le loro pareti cellulari sono modificate in modo che il DNA possa passare più facilmente. Tali cellule sono dette "competenti".
Esistono due metodi principali per trasformare le cellule batteriche: l'uso di cellule chimicamente competenti e l'elettroporazione. Le cellule chimicamente competenti vengono create utilizzando una serie di lavaggi con sale freddo per disgregare le membrane cellulari, preparando le cellule ad accettare il DNA plasmidico. Per preparare le cellule elettrocompetenti, le cellule vengono raffreddate e lavate con acqua deionizzata fredda e glicerolo.
Per introdurre il plasmide desiderato nelle cellule chimicamente competenti, il DNA plasmidico viene mescolato con le cellule raffreddate e incubato in ghiaccio per consentire al plasmide di entrare in stretto contatto con le cellule. La miscela plasmide-cellula viene quindi riscaldata brevemente a 45–50°C, consentendo al DNA di entrare nella cellula attraverso la membrana rotta. La miscela riscaldata viene poi rimessa in ghiaccio per trattenere i plasmidi all'interno dei batteri.
Per l'elettroporazione, anche le cellule competenti si trovano nel ghiaccio con il DNA plasmidico. Tuttavia, la miscela plasmide-cellula viene esposta a una corrente elettrica che apre i pori nella membrana cellulare in modo che il plasmide possa entrare nella cellula.
Entrambi i metodi consentono un recupero efficiente delle cellule trasformate utilizzando una selezione antibiotica per il plasmide di interesse.
