Coinvolgimento del bersaglio chinasi
Il saggio NanoBRET™ Target Engagement (TE) Intracellular Kinase Assays consente di misurare quantitativamente le interazioni specifiche chinasi-inibitore in cellule vive utilizzando il trasferimento di energia di risonanza della bioluminescenza (BRET). Il saggio misura l'affinità cellulare apparente dei composti in esame legati mediante spostamento competitivo di un tracciante fluorescente NanoBRET™ permeabile alla cellula, legato reversibilmente a una fusione chinasi-NanoLuc® luciferasi nelle cellule.
NanoBRET® Kinase Target Engagement Assays
- Misurare il coinvolgimento del bersaglio chinasi in cellule vive: Quantificare l'affinità dei composti & occupazione frazionale per diversi tipi di inibitori di chinasi (I-IV).
- Saggi per oltre 340 chinasi: I saggi pronti all'uso coprono l'intero chinoma, consentendo facilmente l'analisi della selettività.
- Utilizzo di chinasi a lunghezza intera: I saggi utilizzano chinasi wild-type complete. Sono disponibili saggi di chinasi mutanti o di domini specifici.
- Formato della piastra a più pozzetti: Il semplice metodo di analisi è scalabile da 96 a 384 pozzetti e oltre.
- Valutazione del tempo di permanenza: Determinare la durata del legame del composto in esame con la chinasi bersaglio in cellule vive.
Cosa serve per eseguire un test NanoBRET™ TE
I traccianti e le combinazioni substrato/inibitore sono disponibili anche come prodotti autonomi.
Sono disponibili test per oltre 340 chinasi
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Come funzionano i test di coinvolgimento del bersaglio chinasi di NanoBRET™
Un vettore di fusione chinasi-NanoLuc® viene introdotto mediante trasfezione in cellule di mammifero e lasciato esprimere. Poiché la luciferasi NanoLuc® è estremamente luminosa, è necessaria solo una bassa espressione della proteina di fusione chinasi-NanoLuc®.
Nel saggio NanoBRET® TE Kinase Assay, vengono forniti un tracciante fluorescente NanoBRET™ permeabile alle cellule, un substrato NanoLuc® e l'inibitore NanoLuc® extracellulare. L'aggiunta di questi elementi a cellule che esprimono la fusione chinasi-NanoLuc® consente di ottenere un forte segnale BRET tra la proteina chinasi-NanoLuc® e il tracciante NanoBRET™. L'inibitore extracellulare di NanoLuc® assicura che il segnale BRET ottenuto provenga da cellule vive e non compromesse.
La presenza di un composto di prova non marcato che si lega alla chinasi bersaglio determina una perdita del segnale BRET. Poiché la BRET ha stretti vincoli di distanza, i dati ottenuti sono specifici per la chinasi fusa con NanoLuc® luciferasi. Inoltre, i dati risultano in un'affinità intracellulare quantitativa, a condizione che venga utilizzata la concentrazione appropriata di tracciante.
Esempio di dati sul coinvolgimento del bersaglio chinasi
Misurare affinità, selettività, potenza e tempo di residenza
Ottenere una misurazione quantitativa dell'affinità intracellulare dei composti
Determinare la selettività cellulare dei composti e l'occupazione frazionaria per le chinasi correlate
NanoBRET™ Target Engagement può essere utilizzato per confrontare l'affinità degli inibitori per le chinasi wild-type (WT) e mutanti. Il NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay K-10 è stato utilizzato per JAK e JAK(V617F), una mutazione clinicamente acquisita che si trova nei tumori mieloproliferativi. Pannello A: impegno degli inibitori competitivi ATP di tipo I contro JAK2(V617F). Pannello B: la potenza di aggancio del bersaglio era maggiore per l'inibitore di tipo I ruxolitinib con JAK2(V617F) rispetto a JAK2 wild-type. Pannello C: questa differenza è stata riscontrata con l'inibitore di tipo II CHZ-868, che aveva un'affinità simile sia per la chinasi JAK2(V617F) mutante che per quella JAK2 wild-type.
Ottenere una migliore correlazione tra l'affinità del composto e la potenza funzionale a valle
Valutare il tempo di permanenza dei composti nelle cellule vive
FAQ
I manuali tecnici per i test di chinasi intracellulari NanoBRET™ TE (#TM598 e #TM603) utilizzano cellule HEK293. Tuttavia, sono stati utilizzati altri tipi di cellule, come HeLa e U2OS. Se si utilizzano tipi di cellule diverse dalle HEK293, si raccomanda di ottimizzare le condizioni di trasfezione per introdurre il vettore di fusione chinasi-NanoLuc®.
Il nuovo formato di saggio aderente (ADH) è più efficiente per l'utente rispetto al formato originale con superficie non legante (NBS). Il formato ADH prevede l'uso di cellule aderenti in una piastra trattata con coltura tissutale.
Il formato NBS prevede che le cellule vengano trasfettate in piastre o piatti il giorno prima di essere aggiunte alla piastra di analisi. Il giorno del test, le cellule vengono raccolte e seminate in piastre con superficie non legante prima di eseguire il test. Le piastre con superficie non legante sono ideali per alcuni traccianti con proprietà non ottimali che ne impediscono l'uso nelle piastre di saggio convenzionali in polistirene.
Il formato ADH utilizza piastre trattate per colture tissutali e consente all'utente di trasfettare il vettore di fusione chinasi-NanoLuc® nella piastra di saggio. La fase di raccolta e semina non è necessaria con il formato ADH, poiché le cellule vengono trasfettate e seminate nella piastra di saggio il giorno prima.
Tutte le chinasi e i complessi di chinasi disponibili sono elencati all'indirizzo here con i link alle note applicative e ai dati. Se la chinasi è stata testata anche nel formato NBS, nella tabella viene fornito un link separato alle note applicative. Le note applicative sono disponibili anche nelle pagine dei prodotti per ogni singolo vettore di fusione chinasi-NanoLuc®.
Per ogni chinasi, c'è un saggio/tracciante raccomandato, in quanto fornisce la finestra di saggio più ampia. Tuttavia, diverse chinasi hanno note applicative aggiuntive che utilizzano saggi alternativi. Ulteriori dati al di là del dosaggio raccomandato sono disponibili sulla pagina del prodotto del vettore di fusione chinasi-NanoLuc® quando disponibile.
A seconda delle esigenze, può essere vantaggioso disporre di un saggio con la finestra più ampia, quindi il saggio consigliato è quello da selezionare. In altri casi, può essere preferibile lavorare con lo stesso saggio/tracciante per più chinasi. In questo caso, il saggio consigliato potrebbe non essere lo stesso per ogni chinasi studiata. Fare riferimento a #TM598 o #TM603 per le linee guida sulla finestra del saggio e sulle capacità del saggio.
Sono stati sviluppati altri vettori di fusione chinasi-NanoLuc® e saggi di chinasi NanoBRET™ TE, disponibili attraverso il nostro servizio Tailored R&D Solutions (TRS). Se non è stato sviluppato un saggio per la chinasi, il team TRS può svilupparne uno per voi o guidarvi nello sviluppo del vostro saggio. Una risorsa per lo sviluppo di saggi NanoBRET™ TE è disponibile anche in questo capitolo di Methods in Molecular Biology. Si prega di informarsi qui.
Pubblicazioni
Profilazione quantitativa e ad ampio spettro delle chinasi in cellule vive per valutare l'effetto dell'ATP cellulare sul coinvolgimento dei bersagli
In questo articolo del 2018su Cell Chemical Biology, Vasta et al. descrivono un metodo basato sul trasferimento di energia di risonanza della bioluminescenza (BRET) per misurare l'impegno del bersaglio della chinasi all'interno di cellule vive.
Un saggio BRET ad alto rendimento per il coinvolgimento del bersaglio cellulare collega l'attività biochimica a quella cellulare della tirosin-chinasi di Bruton
In questo articolo di SLAS Discovery 2019, Ong et al. utilizzano i metodi NanoBRET™ TE per caratterizzare l'occupazione del bersaglio per BTK.
Quantificazione della selettività degli inibitori CDK in cellule vive
In questo articolo pubblicato nel 2020 su Nature Communications, i team di dello Structural Genomics Consortium e di Promega hanno utilizzato la tecnologia NanoBRET™ Target Engagement per scoprire sorprendenti modelli di selettività per i CDKI pubblicizzati e per i farmaci clinici abbandonati.
Come possiamo aiutarvi?
Oltre ai saggi di chinasi precostituiti presentati in questa pagina, offriamo anche kit e reagenti per costruire i propri saggi NanoBRET™ Target Engagement e capacità di sviluppo di saggi personalizzati.
