GTPase-Glo™ Assay
Simple, Sensitive GTPase Activity Assay
- Simple add-and-read format
- Suitable for 96-, 384- and 1536-well plates
- Low background and large dynamic range
Catalog Number:
Size
Catalog Number: V7681
Catalog Number: V7682
Rilevazione bioluminescente delle attività di GTPasi, GAP e GEF
Il saggio GTPase-Glo™ è un saggio omogeneo bioluminescente utilizzato per misurare le attività delle GTPasi e delle proteine ad esse associate (GEF e GAP) in vitro. Il test quantifica la quantità di GTP rimanente dopo una reazione con una GTPasi.
Con il saggio GTPase-Glo™ è possibile misurare l'attività intrinseca della GTPasi, l'attività della GTPasi stimolata da GAP, l'attività di GAP e GEF. Il kit contiene tamponi di reazione ottimizzati, GTPase/GAP Buffer e GEF buffer, per l'esecuzione di reazioni di GTPasi e GAP e di GEF, rispettivamente.
Protocollo "aggiungi e leggi" semplice
Il saggio GTPase-Glo™ misura l'attività della GTPasi rilevando la quantità di GTP rimanente dopo l'idrolisi del GTP in una reazione di GTPasi. Dopo la reazione di GTPasi, l'aggiunta del reagente GTPase-Glo™ converte il GTP rimanente in ATP, che viene convertito in un segnale luminescente con l'aggiunta del reagente di rivelazione.
L'attività di GTPasi, GAP e GEF è inversamente correlata alla quantità di luce prodotta. Una GTPasi molto attiva idrolizza una maggiore quantità di GTP, riducendo la quantità di ATP prodotta dal GTP e riducendo la produzione di luce. Una GTPasi meno attiva idrolizza meno GTP, lasciando una maggiore quantità di GTP da convertire in ATP e producendo più luce.
Il diagramma a sinistra mostra le GTPasi in fase attiva e inattiva in relazione a GDP e GTP. Il diagramma a destra è uno schema del protocollo del saggio GTPasi-Glo™.
Monitoraggio di una serie di proteine GTPasi-modulanti (ad es. GEFS, gapS)
Per mediare il processo di shuttling tra la forma attiva e quella inattiva, le GTPasi hanno bisogno dell'aiuto di due famiglie di proteine: Le proteine attivanti le GTPasi (GAP) e i fattori di scambio di guanina nucleotide (GEF). I GEF sostituiscono il PIL legato alla GTPasi inattiva con il GTP, rendendo l'enzima attivo e in grado di trasdurre un'ampia varietà di segnali cellulari. Le GTPasi richiedono quindi l'aiuto delle GAP per idrolizzare il GTP e spegnere la cascata di segnalazione.
Stimolazione dell'attività della GTPasi con GEF
Reactions containing 2µM of wildtype or mutant Ras (RasG12V) plus 1µM of NF1-333 (GAP protein) in GTPase/GAP Buffer.
Reactions containing 2µM of wildtype or mutant Ran (RanE70A) plus 1µM of RanGAP (GAP protein) in GTPase/GAP Buffer.
Stimolazione dell'attività delle GTPasi da parte delle proteine GAP
Rilevazione sensibile degli enzimi modulatori di GTPasi
Il saggio GTPase-Glo™ rileva basse quantità di nanogrammi di enzimi modulatori di GTPasi in una reazione chimica.
Valutazione delle attività GAP di NF1-333 e RanGAP con il saggio GTPase-Glo™.
Questo esperimento mostra una titolazione di NF1-333 o RanGAP in presenza di una concentrazione fissa della GTPasi cognata (Ras o Ran, rispettivamente).
NF1-333 o RanGAP sono stati diluiti in serie in tampone GTPase/GAP e 5µl sono stati dispensati in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti. Ai GAP dispensati sono stati aggiunti cinque microlitri di soluzione 2X GTPase-GTP contenente 2µM Ras o 2µM Ran e 10µM GTP in tampone GTPase/GAP. Le reazioni di GTPasi sono state incubate per 2 ore a temperatura ambiente, quindi sono stati aggiunti 10µl di Reagente GTPasi-Glo™ ricostituito. Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, sono stati aggiunti 20µl di reagente di rivelazione, le reazioni sono state incubate per 5 minuti e la luminescenza è stata registrata.
Protocols
Complete Protocol
Specifications
Catalog Number:
What's in the box
| Item | Part # | Choose a size | Concentration | Available Separately |
|---|---|---|---|---|
rGTP |
P115A | 1 × 50μl | 10mM | View Product |
|
DTT |
P117A | 1 × 100μl | 100mM | View Product |
GTPase/GAP Buffer |
V763A | 1 × 5ml | ||
GEF Buffer |
V764A | 1 × 5ml | ||
GTPase-Glo™ Buffer |
V765A | 1 × 5ml | ||
GTPase-Glo™ Reagent, 500X |
V766A | 1 × 15μl | ||
Detection Reagent |
V767A | 1 × 10ml | ||
|
ADP, 10mM |
V916A | 1 × 500μl |
SDS
Search for SDSCertificate of Analysis
Use Restrictions
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.Storage Conditions
What's in the box
| Item | Part # | Choose a size | Concentration | Available Separately |
|---|---|---|---|---|
|
rGTP |
P115B | 1 × 0.5ml | 10mM | View Product |
|
DTT |
P117C | 1 × 1.25ml | 100mM | View Product |
GTPase/GAP Buffer |
V763B | 1 × 50ml | ||
GEF Buffer |
V764B | 1 × 50ml | ||
GTPase-Glo™ Buffer |
V765B | 1 × 50ml | ||
GTPase-Glo™ Reagent, 500X |
V766B | 1 × 120μl | ||
Detection Reagent |
V767B | 1 × 100ml | ||
|
ADP, 10mM |
V916A | 1 × 500μl |
SDS
Search for SDSCertificate of Analysis
Use Restrictions
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.Storage Conditions
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