Rilevamento dell'autofagia

L'autofagia è un processo di degradazione intracellulare che è implicato in molte condizioni fisiologiche e patologiche. Quando l'autofagia è indotta, si forma una membrana di isolamento che racchiude parte del citoplasma e forma una vescicola a doppia membrana (autofagosoma). La membrana esterna dell'autofagosoma si fonde con un lisosoma per formare l'autolisosoma, che degrada i componenti dell'organello inglobato insieme alla membrana interna dell'autofagosoma. Il termine "flusso autofagico" si riferisce all'intero processo dinamico dell'autofagia.

L'LC3B dei mammiferi è un marcatore dell'autofagosoma che viene processato da Atg4 al suo C-terminus per diventare LC3-I. LC3-I è per lo più citosolico, ma viene lipidato attraverso la coniugazione con la fosfatidiletanolamina (PE) per formare LC3-II che si localizza sia sulla membrana esterna che su quella interna dell'autofagosoma. Al momento della fusione dell'autofagosoma con il lisosoma, la LC3-II legata alla membrana interna viene degradata dalle proteasi lisosomiali. Il monitoraggio della conversione di LC3-I in LC3-II attraverso la variazione del peso molecolare è un metodo comune per monitorare i cambiamenti nella via autofagica. L'imaging della localizzazione di LC3B nella cellula, da diffusa (sotto forma di LC3-I citostolica) a concentrata (LC3-II in autofagosomi o puncta), è un ulteriore metodo per monitorare i cambiamenti nell'autofagia.

Esistono diversi metodi per monitorare la formazione di autofagosomi e il flusso autofagico. Tuttavia, ogni metodo ha i suoi limiti e per convalidare l'attività autofagica è necessario utilizzare più di un metodo. Ad esempio, l'utilizzo del numero di autofagosomi determinato dalla localizzazione di GFP-LC3 è un metodo comune per misurare l'attività autofagica. Tuttavia, i risultati potrebbero essere fuorvianti perché sia l'induzione che l'inibizione dell'autofagia possono portare a un aumento dell'accumulo di autofagosomi, a seconda del punto della via in cui avviene la perturbazione.

Il sistema Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay può essere utilizzato in tre moduli di rilevamento per quantificare senza ambiguità il flusso autofagico. In primo luogo, il saggio reporter misura il flusso autofagico monitorando i livelli totali del reporter LC3 in un saggio basato su un lettore di piastre. Le cellule che esprimono stabilmente il reporter dell'autofagia e vengono trattate con stimolatori dell'autofagia mostrano una diminuzione del segnale luminescente. Il trattamento con inibitori dell'autofagia determina un aumento del livello del reporter LC3 e quindi un segnale luminescente più elevato. In secondo luogo, il tag HiBiT sul reporter LC3 può essere utilizzato con il sistema di blotting Nano-Glo® HiBiT per monitorare il cambiamento di peso molecolare da LC3-I a LC3-II. Questo sistema sostituisce i macchinosi western blot con un protocollo più semplice e veloce. Infine, la porzione di HaloTag® del reporter può essere utilizzata con coloranti fluorogenici per visualizzare la posizione di LC3 all'interno delle cellule. L'uso di un singolo reporter per eseguire saggi quantitativi basati su plate-reader, insieme a saggi di imaging e blotting complementari, consente un'analisi versatile della via autofagica.