RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay
Simple, Plate-Based Assay for Real-Time Apoptosis Detection
- No-wash, one-step Annexin V assay
- Non-lytic; allows continual monitoring of cell state to determine apoptotic onset
- Scalable for high-throughput screening applications
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Catalog Number: JA1011
Catalog Number: JA1012
Catalog Number: JA1000
Catalog Number: JA1001
Monitoraggio in tempo reale della progressione dell'apoptosi
Il saggio RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay misura l'esposizione in tempo reale della fosfatidilserina (PS) sul foglietto esterno delle membrane cellulari durante il processo apoptotico. Le proteine di fusione dell'Annexin V luciferasi fornite nel reagente del saggio si legano alla PS durante l'apoptosi precoce e vengono rilevate con un semplice segnale di luminescenza. Il reagente del test include anche un colorante che lega il DNA, che entra nella cellula e genera un segnale fluorescente alla perdita dell'integrità della membrana.
La combinazione e la tempistica dei segnali luminescenti (legame con l'annessina V) e fluorescenti (rilascio del DNA) viene utilizzata per differenziare la necrosi secondaria che si verifica durante l'apoptosi tardiva dalla necrosi causata da altri eventi citotossici.
Il test RealTime-Glo™ per l'apoptosi e la necrosi dell'Annexina V non è litico e il semplice metodo “ add-and-read” consente letture multiple da un singolo pozzetto del test. L'apoptosi può essere monitorata in tempo reale, senza bisogno di piastre multiple, di un'elaborazione complicata o di apparecchiature di rilevamento specializzate. L'unico strumento necessario è un lettore multimodale in grado di rilevare luminescenza e fluorescenza.
Come funziona il test dell'annessina V
Basato sulla tecnologia binaria NanoLuc® (NanoBiT), il RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay utilizza proteine di fusione di Annexin V contenenti subunità complementari di luciferasi NanoBiT® (Annexin V-LgBiT e Annexin V-SmBiT). Quando sono vicine, le subunità LgBiT e SmBiT si uniscono per formare una luciferasi funzionale.
Cellula sana
Il reagente di rilevazione contiene proteine di fusione Annexin V-LgBiT e Annexin V-SmBiT (NanoBiT) e un colorante DNA profluorescente.
Apoptosi precoce
La luminescenza rimane bassa fino a quando l'esposizione a PS non avvicina le proteine di fusione dell'Annexin V, formando una luciferasi funzionale.
Necrosi secondaria
Un segnale fluorescente è generato dalla perdita dell'integrità della membrana durante l'apoptosi in fase avanzata, quando il colorante del DNA può entrare nella cellula.
La misurazione del legame dell'Annexin V (luminescenza) e della perdita di integrità della membrana (fluorescenza) ripetutamente dallo stesso pozzetto di campione dopo l'esposizione a un composto di prova consente di risolvere gli effetti degli stimoli citotossici e di determinare il meccanismo d'azione. In questo caso, il ritardo temporale tra la comparsa del legame tra fosfatidilserina e Annexin V e la perdita di integrità della membrana indica un fenotipo apoptotico che porta alla necrosi secondaria.
Aggiungere un reagente, leggere ripetutamente
Dosi diverse, punti temporali multipli, una piastra di analisi
Con questo test dell'Annexina V in tempo reale, le misure ripetute della luminescenza e della fluorescenza dallo stesso pozzetto durante l'esposizione al composto consentono di determinare l'efficacia del composto utilizzando un numero di piastre e di reagenti molto inferiore rispetto ai test endpoint.
Il reagente è ben tollerato da una varietà di tipi di cellule in coltura e può essere applicato prima del trattamento o al momento della somministrazione per misurare in tempo reale l'entità della progressione apoptotica dipendente dalla dose e dal tempo.
Test dell'apoptosi RealTime-Glo™
Punti dati multipli. Aggiunta di un solo reagente. Una piastra di analisi.
I dati per ciascuna dose sono stati ottenuti in più punti temporali utilizzando una singola piastra di analisi con un'unica aggiunta di reagente.
Test endpoint
Punti dati multipli. Piastre di analisi multiple.
In questo caso, sono state necessarie 7 piastre per ottenere i dati che si potrebbero ottenere utilizzando una singola piastra con il test in tempo reale.
Vedere altri dati: Per saperne di più su questi dati e vedere come il RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay può essere utilizzato con vari modelli cellulari per esplorare la sicurezza e l'esposizione nel poster AReal-Time, Bioluminescent Annexin V Assay for the Assessment of Apoptosis, presentato al SOT 2017.
I risultati sono coerenti con quelli dei metodi di legame dell'annessina fluorescente rilevati mediante citometria a flusso.
In questo esperimento, le cellule K562 sono state esposte a varie dosi di bortezomib per 16 ore.
Pannello superiore: Le cellule sono state raccolte, lavate e marcate con Alexa Fluor® 488 (fluorescenza verde, legame fosfatidilserina:Annexin V) e 7-AAD (fluorescenza rossa, integrità della membrana) e analizzate mediante citometria a flusso (10.000 eventi).
Pannello inferiore: Le cellule K562 (10.000/pozzetto) sono state esposte a diluizioni seriali di bortezomib in presenza del reagente RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay. La luminescenza (legame fosfatidilserina:Annexin V) e la fluorescenza (integrità della membrana) sono state registrate cineticamente. È mostrata l'incubazione di 16 ore con bortezomib.
See More Data: Ulteriori dati che illustrano come il metodo in tempo reale possa essere utilizzato per differenziare le modalità di morte cellulare sono disponibili nel poster AReal-Time, Plate -based Annexin V Method for Monitoring Programmed Cell Death, presentato all'AACR 2017.
Disponibile con o senza reagente di rilevamento della necrosi
RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay
(Cat.# JA1011 e JA1012)
Include il reagente per il rilevamento della necrosi, un colorante DNA profluorescente permeabile alle cellule. Alla perdita dell'integrità della membrana, il colorante entra nella cellula e si lega al DNA, generando un segnale fluorescente.
RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay
(Cat.# JA1000 e JA1001)
Non include il reagente per la rilevazione della necrosi. Sebbene il test possa essere condotto senza una sonda di rilevamento della necrosi, il meccanismo d'azione dell'esposizione a PS non sarà rivelato. Pertanto, quando si utilizzano le cat. JA1000 o JA1001, si consiglia di incorporare un colorante cianino asimmetrico come CellTox™ Green (cat. G8742) o molecole strutturalmente correlate, per ottenere la piena funzionalità del saggio e la chiarezza dei dati.
Customer Testimonial
Challenge:
Grant Harradence, manager of the Bioassay Department at Abzena, oversees successful implementation of cytotoxicity assays to identify promising lead candidates. He and his team needed more data per assay to better understand bioconjugates mode of action and kinetics. End-point assays were too limiting and time-consuming.
Result:
The team integrated RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay to their workflow with no challenging optimizations, and were able to capture more information with fewer assays.
Their workflow also includes CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay for cell viability. The expanded data available to their clients and partners has helped them strengthen their collaborative research relationships.
Protocols
Specifications
Catalog Number:
What's in the box
| Item | Part # | Choose a size |
|---|---|---|
Annexin V-SmBiT Reagent (1,000X) |
J700A | 1 × 25μl |
CaCl2 (1,000X) |
J750A | 1 × 250μl |
Annexin V-LgBiT Reagent (1,000X) |
J800A | 1 × 25μl |
Annexin V NanoBiT® Substrate, 1,000X |
JA100A | 1 × 25μl |
Necrosis Detection Reagent, 1,000X |
JA101A | 1 × 25μl |
SDS
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Use Restrictions
For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.Storage Conditions
U.S. Pat. No. 8,809,529, European Pat. No. 2635582, Japanese Pat. No. 5889910 and other patents and patents pending.
U.S. Pat. Nos. 8,598,198 and 9,458,499 and other patents and patents pending.
U.S. Pat. Nos. 9,797,889, 9,797,890 and 11,493,504; European Pat. No. 2970412; Japanese Pat. Nos. 7280842 and 7532562; and other patents pending.
What's in the box
| Item | Part # | Choose a size |
|---|---|---|
Annexin V-SmBiT Reagent (1,000X) |
J700B | 1 × 250μl |
CaCl2 (1,000X) |
J750A | 1 × 250μl |
Annexin V-LgBiT Reagent (1,000X) |
J800B | 1 × 250μl |
Annexin V NanoBiT® Substrate, 1,000X |
JA100B | 1 × 250μl |
Necrosis Detection Reagent, 1,000X |
JA101B | 1 × 250μl |
SDS
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U.S. Pat. Nos. 9,797,889, 9,797,890 and 11,493,504; European Pat. No. 2970412; Japanese Pat. Nos. 7280842 and 7532562; and other patents pending.
What's in the box
| Item | Part # | Choose a size |
|---|---|---|
Annexin V-SmBiT Reagent (1,000X) |
J700A | 1 × 25μl |
CaCl2 (1,000X) |
J750A | 1 × 250μl |
Annexin V-LgBiT Reagent (1,000X) |
J800A | 1 × 25μl |
Annexin V NanoBiT® Substrate, 1,000X |
JA100A | 1 × 25μl |
SDS
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|---|---|---|
Annexin V-SmBiT Reagent (1,000X) |
J700B | 1 × 250μl |
CaCl2 (1,000X) |
J750A | 1 × 250μl |
Annexin V-LgBiT Reagent (1,000X) |
J800B | 1 × 250μl |
Annexin V NanoBiT® Substrate, 1,000X |
JA100B | 1 × 250μl |
SDS
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