Piccoli cambiamenti dal grande impatto: il ruolo della variante genetica nello sviluppo delle malattie

20.07.20 – Giacomo Grisafi

Comprendere come gli stati patologici derivino da varianti genetiche è importante per comprendere la progressione della malattia ed eventuali meccanismi di resistenza. Quando due persone hanno la stessa variante genetica, ma solo una è affetta da patologia, capire lo sviluppo della stessa può essere infatti molto complicato.

A fare un po' di chiarezza ci ha provato un team di ricercatori italiani del Dipartimento di Bioscienze dell'Università degli Studi di Milano, che ha utilizzato il next generation sequencing (NGS) in combinazione con l'analisi RNA e i test di metilazione del DNA per studiare le varianti genetiche dell'enzima Ferrochelatasi (FECH) che portano allo sviluppo della patologia nota come Protoporfiria Eritropoietica (EPP). Lo studio, che è stato effettuato esaminando il locus FECH di 72 individui appartenenti a 24 famiglie con EEP, ha dato risultati molto interessanti che permetteranno un passo in avanti nella comprensione della patogenesi di questa patologia.

FECH e EPP, qual è la correlazione?

FECH è il gene della ferrochelatasi, l'ultimo enzima nel processo di sintesi per il gruppo eme. Il disturbo metabolico ereditario, l'EPP, sopraggiunge quando l'attività della ferrochelatasi è ridotta a meno di un terzo rispetto ai suoi livelli normali, portando il conseguente aumento dei livelli di protoporfirina (PPIX) senza metallo negli eritrociti. Le conseguenze di una PPIX a basso contenuto di metallo sono fototossicità, che può causare gravi reazioni cutanee, e lesioni epatiche dovute all'accumulo di PPIX nel fegato.

In che modo l'espressione di FECH incide sull'EPP?

Il progredire della malattia EPP non è semplicemente dovuto alla mancanza di due alleli FECH funzionali. La malattia si verifica in presenza di un allele ipomorfo, ovvero con mutazioni della ferrochelatasi che ne riducono la funzionalità, in trans ad un allele FECH nullo. I ricercatori del Dipartimento di Bioscienze dell'Università degli Studi di Milano si sono concentrati su tre varianti genetiche comuni chiamate aplotipo GTC, che sono associate a expression quantitative trait loci (eQTL) colpevoli di ridurre l'attività FECH. Tre varianti genetiche trovate curiosamente tutte in trans. La missione dei ricercatori era di scoprire l'eventuale presenza di individui omozigoti per l'allele GTC e, eventualmente, valutarne la patogenesi.

Le scoperte del team di ricerca italiano

L'analisi NGS ha identificato cinque individui omozigoti per l'allele GTC, di cui quattro con diversi gradi di EPP e uno asintomatico. Ripetendo il sequenziamento del gene FECH nelle 24 famiglie di partenza, il team italiano ha scoperto due nuove varianti introniche (di cui una a bassa frequenza) associate esclusivamente ai quattro individui omozigoti GTC che hanno sviluppato EPP. Per studiare in che modo la nuova variante genetica abbia influenzato l'espressione della ferrochelatasi è stata quindi utilizzata l'RT-PCR, che ha mostrato un'alterazione dello splicing con inserzione di un codone di stop da uno pseudo-esone. Queste varianti sono state trovate in cis ad uno dei due alleli ipomorfi.

Esaminando l'ereditarietà di 446 varianti di alleli ipomorfi FECH è emerso come queste varianti genetiche facessero parte dello stesso aplotipo da 20kb che contiene l'allele GTC.

Essendo noto che la metilazione del DNA intronico regola lo splicing, il team di ricerca ha quindi studiato i siti CpG in FECH per scoprire che la nuova variante intronica aggiunge un sito di metilazione CpG, mentre altre due varianti portano alla perdita di due siti analoghi. L'RT-PCR ha analizzato quindi la variante che rimuove il sito CpG trovando un'isoforma di splicing che causa il salto di un esone e l'inserzione nel trascritto di parte di un introne.

L'importanza della scoperta

I ricercatori italiani hanno scoperto una nuova variante di FECH, che gioca un ruolo cruciale nella riduzione dell'attività dell'enzima e, di conseguenza, nello sviluppo dell'EPP. Studiando individui che erano omozigoti per alleli FECH ipomorfi, il team ha scoperto anche come diversi meccanismi in cis possano influenzare lo sviluppo dell'EPP. I risultati ottenuti suggeriscono quindi che piccole differenze nel gene FECH, oltre agli alleli o alle varianti conosciute, siano in grado di influenzare lo sviluppo e la gravità della malattia.

Gli strumenti utilizzati per la ricerca

"Per la diagnosi di routine è stato utilizzato l'estrattore automatico Maxwell di Promega; poter usare lo stesso campione di DNA anche per applicazioni NGS ci ha permesso di risparmiare tempo e di ottenere dati più consistenti. Inoltre la quantificazione in fluorimetria effettuata utilizzando il Glomax ci ha garantito affidabilità e rapidità." Dott.ssa Elena Di Pierro.

Il DNA genomico è stato isolato dai campioni di sangue periferico grazie all'estrattore Maxwell® e poi quantificato quantificato in fluorescenza con il sistema QuantiFluor® ONE dsDNA e il lettore di micropiastre GloMax Discover®. Il DNA purificato è stato quindi utilizzato per la costruzione di librerie NGS per il sequenziamento del gene FECH.

L'RNA totale è stato estratto da campioni di sangue periferico sempre tramite Maxwell®, utilizzando il kit Maxwell® 16 LEV SimplyRNA . 400 ng di RNA purificato sono poi stati utilizzati per l'analisi RT-PCR.

Infine, per l'analisi della metilazione del DNA, il DNA trattato con bisolfito è stato amplificato utilizzando GoTaq® Hot Start Green Master Mix e successivamente purificato con beads di sefarosio prima del pirosequenziamento.

Referenze: Targeted resequencing of FECH locus reveals that a novel deep intronic pathogenic variant and eQTLs may cause erythropoietic protoporphyria (EPP) through a methylation-dependent mechanism. Genet. Me. 22, 35–43. doi:10.1038/s41436-019-0584-0. 

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