Studiare l'ipossia attraverso i geni reporter: il lavoro del premio Nobel Semenza

L'ossigeno è essenziale per la respirazione cellulare e la produzione di energia (ATP) di cui ogni essere vivente ha bisogno per sopravvivere. Data la necessità, non sorprende come i nostri corpi abbiano sviluppato modi per adattarsi a condizioni di carenza di ossigeno (ipossia). All'occorrenza siamo infatti in grado di aumentare la produzione di nuovi vasi sanguigni tramite il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) così come dei globuli rossi (RBC) tramite eritropoietina (EPO), l'ormone che svolge un ruolo chiave nella produzione di globuli rossi.

Come fa però il nostro corpo a rilevare un basso livello di ossigeno, aumentare di conseguenza i livelli di EPO e mettere in moto la produzione di globuli rossi? Il premio Nobel Gregg L. Semenza, grazie alla sua ricerca è riuscito a far luce su questo processo sfruttando la potenza della bioluminescenza e dei geni reporter.

Scopriamo in questo articolo lo studio del premio Nobel Gregg L. Semenza sull'ipossia.

Semenza, il Nobel e i primi studi sull'ipossia

Era il 2019 quando tre ricercatori, William G. Kaelin Jr., Sir Peter J. Ratcliffe e Gregg L. Semenza hanno ricevuto il Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina grazie alle loro scoperte su come le cellule percepiscano e si adattino alla disponibilità di ossigeno. Qui approfondiamo il lavoro di Semenza, in cui fa luce sugli elementi di regolazione che consentono a geni come EPO e VEGF di essere iper-regolati in risposta a condizioni ipossiche.

Il lavoro di Semenza ha richiesto l'uso di un gene reporter, ma cos'è un gene reporter? I geni reporter sono geni che codificano per proteine facilmente quantificabili e che quindi consentono di monitorare l'attività di specifiche regioni regolatrici che ne possano aumentare o ridurre la sintesi. Un costrutto reporter composto da gene e sequenze regolatrici può essere transfettato transitoriamente in una cellula bersaglio, da cui poi può essere estratta e quantificata la proteina i cui livelli rispecchiano l'attività delle sequenze in analisi (guarda questo video per saperne di più).

Semenza e il suo team già nel 1991 hanno usato l'enzima cloroamfenicolo acetiltransferasi (CAT), un reporter all'epoca molto comune, per comprendere il meccanismo molecolare dell'induzione dell'EPO in condizioni di ipossia. Creando un costrutto reporter CAT contenete la regione 3' del gene EPO, dimostrarono come una regione di 256 bp portasse a una maggiore espressione del reporter CAT quando le cellule vengono coltivate in condizioni di basso ossigeno. La funzione di questa sequenza genomica è diventata chiaro quando è stato osservato come, anche in assenza di altre sequenze di contorno, il gene reporter sottoposto alla sua regolazione mantiene lo stato di inducibilità correlato all'ipossia.

Solo un anno dopo, nel 1992, Semenza esegue la dissezione funzionale di questa sequenza di 256 bp per comprendere esattamente quali elementi genomici siano critici per la risposta ipossica (Semenza e Wang 1992). Nei suoi test, le regioni del DNA vengono sminuzzate e mutate per comprendere le sequenze di DNA minime fondamentali per la regolazione genica.

Poiché questo lavoro è stato svolto mediante trasfezione transitoria, la normalizzazione del reporter sperimentale è servito a dimostrare come i cambiamenti osservati nell'espressione del reporter siano causati da delle differenze nella sequenza del DNA, e non piuttosto da differenze in altri fattori come ad esempio l'efficienza di trasfezione. Per raggiungere il risultato, Semenza ha utilizzato un approccio dual-reporter, normalizzando un reporter sperimentale CAT a partire da un controllo β-galattosidasi espresso costitutivamente.

Questi test hanno dimostrato come all'interno della sequenza originale di 256 bp, una sequenza di 50 bp potesse essere completamente funzionale come attivatore inducibile dall'ipossia. Questa sequenza, che Semenza ha definito un elemento di risposta all'ipossia (HRE), lega due fattori nucleari: uno costitutivo e uno indotto da bassi livelli di ossigeno, da allora chiamato fattore 1 inducibile dall'ipossia (HIF-1) di Semenza.

Il gene reporter della luciferasi

Semenza e il suo team hanno continuato ad esplorare il ruolo delle proteine HIF nella regolazione dell'ipossia, arrivando nel 1996 a caratterizzare gli elementi di risposta ipossica nei promotori degli enzimi glicolitici ALDA, ENO1 e Ldha, grazie ancora una volta a geni reporter. Il team comincia per la prima volta ad utilizzare un gene reporter Firefly luciferasi (Fluc), soluzione che ha permesso loro di poter disporre di un reporter più veloce e più sensibile rispetto a CAT.

Questo lavoro ha dimostrato il ruolo essenziale di HIF-1 nella regolazione dell'attivazione della trascrizione di ALDA, ENO1 e Ldha nelle cellule in ipossia. È interessante notare come la sequenza ENO1 di 68 bp, che contiene tre siti di legame HIF-1, fosse l'HRE più potente identificato all'epoca. Questo studio ha aiutato a fare luce sul meccanismo molecolare alla base di un importante adattamento cellulare dell'ipossia grave: il passaggio dalla fosforilazione ossidativa alla glicolisi come mezzo principale per generare ATP.

Semenza oggi, focus sull'avanzamento del cancro

Il lavoro di Semenza continua ancora oggi, con un focus sul ruolo di HIF-1 nell'avanzamento del cancro. In uno studio del 2015 viene esaminato il ruolo di HIF-1 nella progressione del cancro al seno, nel tentativo di comprendere come le condizioni ipossiche nell'espressione tumorale impattino su CD47. CD47 è una proteina della superficie cellulare coinvolta nel mantenimento delle cellule staminali tumorali. Questa proteina consente alle cellule tumorali di evitare la distruzione da parte dei macrofagi. Quando è stato eseguito questo studio, la sequenza del genoma umano non era ancora disponibile e potenziali siti di legame HIF sono stati identificati nel gene CD47.

Per caratterizzare funzionalmente le potenziali sequenze HRE, il team di Semenza ha utilizzato nuovamente un approccio a doppio reporter, per poi passare col tempo ad un metodo a doppia luciferasi (utilizzando Fluc come reporter sperimentale e Renilla luciferasi come controllo per la normalizzazione). Questo sistema reporter Dual-Luciferase ha permesso la misurazione sequenziale più efficiente di entrambi i reporter dalla stessa cellula, eliminando la necessità di dividere i lisati ed eseguire la misurazione B / Gal in un test separato (come erano costretti a fare in precedenza).

Grazie a questo approccio, Semenza è riuscito a determinare come l'ipossia cellulare aumenti l'espressione Fluc normalizzata quando espressa a valle di uno dei presunti HRE CD47. Approfondendo ulteriormente il tema, Semenza ha concluso che HIF-1 si lega direttamente al promotore CD47 per attivare la trascrizione genica. Un lavoro che ha fornito informazioni meccanicistiche sul modo in cui le cellule del cancro al seno possono evitare la fagocitosi, oltre che su come vengono mantenute le cellule staminali del cancro. Gli inibitori HIF potrebbero essere una potenziale strategia di trattamento per il cancro? Secondo Semenza, probabilmente sì.

Nel corso degli anni, il laboratorio Semenza ha senza dubbio scoperto molto sull'identificazione originale di HRE e proteine HIF. Diverse forme di HIF sono state caratterizzate, il processo di regolazione HIF è stato scoperto e molti geni sono stati trovati per essere regolati come parte della risposta ipossica cellulare. Ora abbiamo un quadro più chiaro di come le alterazioni omeostatiche dell'ossigeno contribuiscano a molte malattie umane.

Il 2021 segna i 30 anni da quando i primi vettori e reagenti della luciferasi sono diventati protagonisti nella ricerca scientifica. Mentre celebriamo questo traguardo, è entusiasmante guardare indietro per vedere come questi strumenti abbiano consentito a diversi ricercatori, come il premio Nobel Semenza, di compiere progressi significativi nella comprensione dei meccanismi fondamentali della biologia cellulare.

Se sei interessato al tema, scopri come stiamo festeggiando la luciferasi e perché mettiamo in palio 3.000 euro di prodotti Promega!

Ti è piaciuto questo articolo? Condividilo!