Cosa fare quando la RT-qPCR non funziona? Rispondiamo alle 5 domande più comuni

La RT-qPCR per quantificare l'espressione dell'RNA è una tecnica potente, ma non sempre collaborativa. Anche quando si seguono alla lettera i protocolli, possono comparire risultati imprevisti: curve piatte, valori di Cq inaspettati o repliche incoerenti. Quando ciò accade, ci si chiede: cosa è andato storto?

In questo articolo blog rispondiamo alle cinque domande più frequenti quando si lavora con RT-qPCR. Dagli errori più comuni alle sfide più complicate, scopriremo assieme anche cosa considerare quando il problema non è solo questione di tecnica, e quando potrebbe essere il momento di ripensare i reagenti utilizzati.

1. Il tuo RNA è di alta qualità?

Prima di immergerci in curve o modelli di amplificazione, è essenziale controllare il materiale di partenza. L'RNA degradato o impuro può portare a repliche incoerenti, amplificazione ritardata o assenza di segnale.

Cosa controllare:

• Il campione è stato esposto a RNasi o sottoposto a più cicli di congelamento e scongelamento?
• Come sono i rapporti A260/280?
• L'RNA deve essere trattato con DNasi per rimuovere la contaminazione genomica?

Cosa provare:

• Utilizzare un inibitore di RNasi come RNAsin® Ribonuclease Inhibitor.
• Eseguire un campione di RNA o DNA di controllo accanto ai campioni sperimentali per confermare se i problemi derivano dal campione o piuttosto dall'impostazione della reazione. Infine, utilizzare un RNA fresco o correttamente conservato.
• Se si salta la purificazione dell'RNA, considera i reagenti che tollerano lisati grezzi, come GoTaq® EndureqPCR Master Mix e RT-qPCR System accoppiati con XpressAmp® Direct Amplification Reagents per flussi di lavoro di amplificazione diretta.  

2. I primer e le sonde sono progettati correttamente?

Primer progettati male o sonde non adeguate possono portare a falsi positivi, risultati poco specifici o curve di amplificazione piatte.

Cosa controllare:

I primer sono specifici per il target e privi di hairpin o dimeri? Si estendono sulle giunzioni esone-esone (per l'amplificazione specifica dell'mRNA)? La temperatura di fusione (Tm) è appropriata per il vostro protocollo?

Cosa provare:

• Utilizzare strumenti di progettazione dei primer come Primer-BLAST.
• Confermare la specificità del prodotto di amplificazione con l'analisi della curva di fusione o l'elettroforesi su gel.
• Includere controlli no-template e no-RT per verificare la presenza di DNA genomico o di amplificazione non specifica.

3. Gli inibitori possono interferire con la reazione?

La sensibilità della RT-qPCR fa sì che anche tracce di inibitori possano interrompere l'amplificazione. Gruppi Eme, etanolo o persino una quantità eccessiva di templato possono bloccare l'attività enzimatica o interferire con la rilevazione della fluorescenza.

Cosa controllare:

• La diluizione del templato migliora l'amplificazione?
• Come sono i rapporti A260/230?
• State utilizzando input come sangue, tessuto vegetale o FFPE?

Cosa provare:

Diluire il templato a 1:10 o 1:100 per vedere se si mantiene una differenza di amplificazione. Includere un controllo di amplificazione interno per distinguere l'inibizione dalla scarsa abbondanza del target. Usare una master mix tollerante agli inibitori, come GoTaq® Endure, che ha prestazioni costanti in tipi di campioni complessi.

4. I vostri valori Cq sono incoerenti o troppo precoci per potersi fidare?

Valori di Cq inaspettatamente precoci o variabili tra le repliche possono indicare contaminazione, variabilità dell'impostazione o problemi di calibrazione della rilevazione.

Cosa controllare:

• Le impostazioni del colorante e della sonda sono corrette, compresa la quantità corretta di colorante di riferimento (se necessario)?
• I primer e i reagenti sono stati preparati di recente e ben miscelati?
• È stata osservata l'amplificazione nel controllo senza piastra?

Cosa provare:

• Quantificare e normalizzare l'input del campione utilizzando un colorante che lega l'RNA, come il QuantiFluor® RNA System.  
• Mescolare accuratamente le reazioni per ridurre al minimo la variabilità.
• Aggiungere una fase di curva di fusione per distinguere il target dagli artefatti.
• Utilizzare puntali con barriera e pulire l'area di lavoro per evitare la contaminazione.

5. Le repliche sono vere repliche?

Quando le repliche tecniche sono in disaccordo, spesso è segno di un errore di impostazione, di una scarsa qualità del modello o di problemi di disposizione delle piastre.

Cosa controllare:

• La reazione PCR è lineare quando viene eseguita con una curva standard di controllo?
• Stai utilizzando le pipette con il volume più piccolo possibile e i puntali a bassa ritenzione?
• Sigilla accuratamente le piastre o prova a non utilizzare i pozzetti del bordo delle piastre da 96 se l'evaporazione è un problema.

Cosa provare:

• Aliquotate i reagenti per evitare cicli ripetuti di congelamento, scongelamento e contaminazione.
• Utilizzare una master mix RT-qPCR in un'unica fase, come GoTaq® Endure RT-qPCR, per ridurre la variabilità causata da più fasi di pipettaggio e manipolazione.

Quando non sei tu, potrebbe essere la tua mix

Anche quando si seguono le istruzioni alla lettera (pipettaggio, convalidazione primer, ottimizzazione cicli), alcune mix non riescono a tenere il passo con le esigenze sperimentali moderne.

Ecco alcuni segnali che indicano che potrebbe essere il momento di cambiare:

• I tuoi campioni sono inconsistenti: le reazioni funzionano con DNA pulito, ma falliscono con lisati grezzi o input di bassa qualità.
• Stai lavorando con templati derivati da matrici più difficili: sangue, materiale vegetale o campioni FFPE spesso contengono inibitori della PCR.
• Stai valutando l'efficienza del workflow: vuoi evitare l'estrazione dell'RNA, ma la tua mix non tollera i lisati diretti.

Il sistema GoTaq® Endure RT-qPCR è stato progettato per soddisfare queste esigenze. Grazie alla forte resistenza agli inibitori e alle prestazioni costanti su campioni difficili, consente un'amplificazione sicura anche quando le condizioni non sono ideali. Se abbinato a XpressAmp™, supporta workflow di amplificazione diretta che riducono i tempi di preparazione, senza sacrificare la qualità dei dati.

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