Cancro e Retrovirus antichi: il ruolo dei retrovirus endogeni nei cambiamenti trascrizionali delle cellule tumorali  

I retrovirus sono un gruppo di virus che utilizzano la trascrittasi inversa per convertire il proprio genoma da RNA a DNA durante il loro ciclo di replicazione virale.

All'incirca 30 milioni di anni fa, un retrovirus endogeno si è integrato nella linea germinale di un antenato comune di babbuini, gorilla, scimpanzé ed esseri umani. Oggi noto come gammaretrovirus umano endogeno 1 (HERV-1), questo retrovirus può fornire indizi sulla regolazione della trascrizione genica che consente alle cellule tumorali di proliferare.

Comprendere il meccanismo alla base dell'espressione genica del cancro

Oggi la comunità scientifica è estremamente consapevole delle sorprendenti differenze nell'espressione genica, nell'attività di segnalazione e nel metabolismo tra le cellule tumorali e quelle normali. Ancora però si fatica a spiegare i complessi meccanismi che causano queste differenze.

Quali eventi biologici sono responsabili dei cambiamenti nell'espressione genica delle cellule tumorali? In un recente articolo pubblicato su Science Advances da Ivancevic et al., i ricercatori dell'Università del Colorado, Boulder, dell'Università del Colorado Anschutz Medical Campus e della University of Colorado School of Medicine hanno lavorato su retrovirus endogeni per rispondere alla domanda.

I ricercatori hanno ipotizzato come gli elementi trasponibili (TE), in particolare quelli associati ai retrovirus endogeni, possano essere coinvolti nella regolazione genica specifica del cancro. I retrovirus endogeni (ERV) sono i resti di antiche infezioni retrovirali che si sono integrate nella linea germinale dell'ospite.

Identificare gli elementi di retrovirus endogeni che influenzano l'espressione genica del cancro

Per identificare i potenziali TE ERV coinvolti nella trascrizione dei geni del cancro i ricercatori hanno analizzato le modifiche epigenetiche in 21 tipi di cancro utilizzando le mappe di accessibilità della cromatina generate dal Cancer Genome Atlas Projects. Analizzando l'attività nell'espressione genica di 1315 adulti sani, sono state trovate 23 sottofamiglie di elementi ripetuti significativamente arricchiti in almeno un tipo di cancro. Di queste, 19 corrispondevano a ripetizioni terminali lunghe di ERV specifici dei primati. Il team ha quindi deciso di concentrarsi sugli elementi LTR10, perché arricchiti in diversi tipi di tumori epiteliali (tra cui il cancro del colon-retto (CRC), dello stomaco, della prostata e del polmone). Inoltre, hanno scoperto come gli elementi LTR10 fossero attivi nei tumori CRC di più individui.

Utilizzando la linea cellulare HCT116 CRC, i ricercatori hanno quindi esaminato i set di dati che descrivono le modifiche epigenetiche del DNA, scoprendo come sia LTR10A che LTR10F avessero marcatori associati all'attività dell'elemento. L'analisi epigenomica dei tessuti normali invece, non ha mostrato marcatori dell'attività di enhancer, ma piuttosto del silenziamento dei trasposoni.

Il ruolo di LTR10 nella regolazione genica con saggi reporter a doppia luciferasi

In una seconda fase dell'esperimento, Ivancevic e colleghi hanno condotto una serie di studi funzionali per comprendere il ruolo degli elementi LTR10 nella regolazione trascrizionale. Poiché le loro analisi hanno rivelato come il fattore di trascrizione AP1 si legasse agli elementi LTR10, e come l'attività trascrizionale di LTR10 fosse correlata al fattore API FOSLI (secondo fattore di trascrizione implicato in diversi tipi di cancro), hanno utilizzato saggi reporter per verificare se l'attività di LTR10 fosse influenzata in caso di interruzione delle vie di segnalazione API/MAPK.

I ricercatori hanno utilizzato NanoLuc® Luciferase e il vettore pGL4.50 Luciferase Reporter per studiare l'attività di enhancer degli elementi LTR10, mentre con il reagente di trasfezione Fugene® hanno trasfettato cellule HCT116 CRC con plasmidi contenenti sequenze LTR10. La luminescenza è stata misurata con il sistema Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay, le letture della luminescenza normalizzate rispetto ai reporter firefly co-trasfettati e attivi in modo costitutivo e i dati presentati come fold of induction rispetto alle cellule trasfettate con un promotore minimale vuoto, pNL3.3. Queste cellule sono state trattate con TNFα o cobimetinib (inibitore di MEK1) per stimolare o inibire la segnalazione.

Cos'hanno rivelato i test? Che gli elementi LTR10 hanno una significativa attività di enhancer che guida l'espressione genica nelle cellule tumorali. I costrutti con motivi AP1 rimescolati sono serviti da controllo e hanno mostrato un'attività ridotta, evidenziando l'importanza dei motivi AP1 nella funzione di enhancer di LTR10.

Come gli elementi LTR10 regolano l'espressione genica con i knockout CRISPR

Partendo dagli studi sull'espressione genica, il team ha utilizzato studi di knockout CRISPR per studiare come gli elementi LTR10 nelle cellule HCT116 CRC regolino l'espressione genica e svolgano un ruolo nella progressione del cancro. La tecnologia CRISPR/Cas9 ha creato knockout mirati di specifici elementi LTR10 nelle cellule HCT116 identificando, nei cambiamenti di espressione genica vicini agli elementi LTR10, i geni che potrebbero essere regolati dagli enhancer LTR10.

Per ottenere maggiori informazioni sui potenziali bersagli regolatori degli enhancer di LTR10, il team ha utilizzato il sequenziamento dell'RNA per cercare i cambiamenti nell'espressione genica in seguito al knockout di LTR10, identificando geni come ATG12, XRCCR e VCAN (noti per essere associati allo sviluppo e alla progressione del cancro), come bersagli della regolazione di LTR10.

ATG12 codifica una proteina necessaria per la macroautofagia, l'omeostasi mitocondriale e l'apoptosi, e la sua espressione è associata allo sviluppo del cancro e alla resistenza ai farmaci. Per determinare se l'enhancer LTR10.ATG12 regolasse l'espressione del gene ATG12 nelle cellule HCT116, i ricercatori si sono chiesti innanzitutto se il silenziamento dell'enhancer provocasse una diminuzione dei livelli di proteina ATG12 nelle cellule, cosa che è avvenuta.

Hanno poi trattato le cellule con staurosporina (STS) per innescare l'apoptosi mitocondriale. Le cellule in cui l'enhancer è stato silenziato hanno mostrato una riduzione dell'attività della caspasi-3/7, valutata con il Caspase-Glo® 3/7 Assay (le caspasi 3 e 7 sono enzimi coinvolti nell'avvio e nell'esecuzione dell'apoptosi).

XRCCR è un gene di riparazione del DNA che è stato implicato nella resistenza dei tumori alla chemioterapia e alla radioterapia. VCAN codifica una proteina della matrice extracellulare che è stata implicata nelle metastasi tumorali. Osservando l'enhancer LTR10.XRCC4, che regola l'espressione di entrambi i geni, i ricercatori hanno cercato di capire se il knockout dell'enhancer influenzasse la risposta delle cellule all'irradiazione. Utilizzando il CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay, hanno valutato la vitalità delle cellule knockout rispetto a quelle wildtype esposte alle radiazioni, scoprendo come le cellule knockout avessero una vitalità ridotta rispetto a quelle wildtype.

In conclusione, questi esperimenti hanno fornito prove convincenti per dimostrare come gli elementi LTR10, attraverso la loro attività di enhancer, influenzino in modo significativo l'espressione genica e il comportamento delle cellule nel cancro del colon-retto. Questo lavoro non solo evidenzia come gli elementi trasponibili del genoma, normalmente silenti, possano riattivarsi dando luogo a una regolazione genica atipica, allo sviluppo e alla progressione del cancro e alla resistenza terapeutica, ma identifica anche un nuovo potenziale bersaglio nella ricerca sulla terapia del cancro.

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