Peptidi ciclici: tecnica one-pot di sintesi e screening  

Nel panorama in continua evoluzione della drug discovery, i peptidi ciclici rappresentano un'opportunità entusiasmante. Questi composti offrono un equilibrio unico tra dimensione e specificità che li rende in grado di colmare il divario tra i farmaci "small molecules" tradizionali e i farmaci biologici più grandi, come gli anticorpi.

Il problema della maggior parte dei peptidi ciclici è la bassa biodisponibilità orale: vengono digeriti dallo stomaco prima di poter entrare nel flusso sanguigno o non vengono assorbiti dal tratto gastrointestinale, con un conseguente scarso effetto terapeutico (1). Lo stesso problema riguarda anche i farmaci biologici, che spesso vengono somministrati per via endovenosa.

Per superare la sfida della bassa biodisponibilità orale dei peptidi ciclici, un team dell'Ecole Polytechnique Fédérale di Losanna, in Svizzera, ha sviluppato un metodo "one-pot" per sintetizzare una libreria diversificata di peptidi ciclici, di cui ha poi vagliato stabilità, attività e permeabilità (1). Il metodo, pubblicato nel dicembre 2023 sulla rivista Nature Chemical Biology, ha semplificato il processo di identificazione e ottimizzazione dei peptidi ciclici e ha segnato un miglioramento sostanziale rispetto agli studi precedenti, in cui i peptidi ciclici sviluppati mostravano una biodisponibilità orale (%F) quasi nulla. Utilizzando questo nuovo approccio, il team ha sviluppato con successo un peptide ciclico con una biodisponibilità orale del 18%F nei ratti.

Perché lavorare sui peptidi ciclici?

I peptidi ciclici sono più grandi della maggior parte dei farmaci e hanno quindi l'opportunità di stabilire interazioni più specifiche e selettive con i bersagli proteici. Gli studi dimostrano come i peptidi ciclici possano legare i bersagli con maggiore affinità rispetto ai loro analoghi lineari, sono meno inclini alla degradazione da parte delle proteasi e mostrano una maggiore capacità di permeare la membrana (2). Per quanto queste caratteristiche siano utili per bersagli proteici tradizionali, con tasche di legame ben definite, i peptidi ciclici potrebbero essere meglio impiegati per legarsi a bersagli proteici non necessariamente provvisti di siti di legame, ma anche per bloccare le interazioni proteina-proteina (3).

Rispetto agli anticorpi, i peptidi ciclici sono più economici da produrre e possono scatenare meno risposte immunogene negative (2,3).

Nonostante il loro potenziale nella drug discovery, i peptidi ciclici devono affrontare una serie di sfide (3). Una di queste è che pochi peptidi ciclici hanno una buona biodisponibilità orale. I peptidi sono grandi rispetto alle small molecules, spesso hanno donatori multipli di legami idrogeno e sono relativamente polari (1). Questi tre fattori possono contribuire a una scarsa biodisponibilità orale, ovvero la percentuale di un farmaco che entra nel flusso sanguigno rispetto alla quantità assunta.

Trovare strategie per migliorare la biodisponibilità orale dei peptidi ciclici è un modo per promuovere lo sviluppo e l'impiego di questa classe di composti farmacologici.

Sintetizzare una libreria di peptidi ciclici

Per iniziare il loro studio, il team di ricerca è partito dalla progettazione e preparazione dei peptidi ciclici per lo screening a valle (1).

Sebbene siano stati riportati diversi approcci per la preparazione e lo screening di librerie di peptidi ciclici, i ricercatori sostengono che la preparazione di alcuni metodi consolidati, come le librerie codificate con il DNA, sia macchinosa. Precedentemente, era stata sviluppata una libreria in cui la formazione di un legame disolfuro produceva i peptidi ciclici. Con questo metodo sono riusciti a preparare rapidamente una libreria di 20.000 membri ma, nel farlo, hanno incontrato delle difficoltà: l'instabilità dei ponti disolfuro e la bassa biodisponibilità orale dei peptidi ciclici.

In questo studio di follow-up, i ricercatori si sono invece affidati alla formazione di peptidi ciclici attraverso un legame tioetere più stabile. Nello specifico, hanno fatto reagire piccoli peptidi contenenti un gruppo tiolo a ciascuna estremità con un legante biselettrofilo. Una volta dimostrato che i peptidi ciclizzati con tioetere erano metabolicamente stabili, hanno sviluppato un metodo per ciclizzare e acilare sequenzialmente i peptidi ciclici in piastre da 96 pozzetti. (L'acilazione rende i peptidi ciclici meno polari).

Con questo metodo, hanno preparato i peptidi ciclici in un singolo pozzetto con un'elevata efficienza per ogni fase chimica. Successivamente, una semplice precipitazione ha fornito peptidi purificati per lo screening a valle. Si è così ottenuta una libreria di 8.448 membri di peptidi ciclici, ognuno dei quali composto da due amminoacidi, un linker e un gruppo introdotto tramite la reazione di acilazione.

Screening e ottimizzazione

Preparata la libreria, i ricercatori hanno verificato l'attività diretta contro la trombina. In uno screening fluorogenico dell'attività della trombina, 73 degli 8.448 peptidi ciclici sono riusciti a inibirla per oltre il 50%. Uno screening successivo con i 20 peptidi ciclici più potenti preparati nello stesso modo ha prodotto attività di inibizione simili, a dimostrazione della coerenza del metodo di preparazione della libreria. I ricercatori hanno anche analizzato la stabilità proteolitica, la permeabilità e la stabilità metabolica dei 20 peptidi ciclici.

Nel complesso, nessun composto della libreria originale soddisfaceva i requisiti di attività, stabilità e permeabilità. I ricercatori hanno quindi creato una nuova libreria di 168 membri basata sul peptide ciclico con l'attività più elevata della prima libreria. Cinque peptidi hanno dimostrato attività e permeabilità sufficienti, ma con una stabilità metabolica troppo bassa.

Il team di ricerca ha poi modificato la preparazione dei peptidi più attivi identificati dalla seconda libreria. Piuttosto che ciclizzare il peptide con un legame tioetere, hanno utilizzato la reazione di metatesi di chiusura dell'anello per ottenere peptidi ciclici con un legante idrocarburico. Gli altri componenti del peptide sono invece rimasti invariati. In un peptide, il legame idrocarburico ha portato a una stabilità metabolica tre volte superiore rispetto allo stesso peptide con un legame tioetere. Tuttavia, la biodisponibilità orale è rimasta piuttosto bassa (appena il 4,5%F).

Per migliorare la biodisponibilità orale del peptide ciclico legato agli idrocarburi, hanno preparato un'altra libreria in cui è stato variato solo il gruppo acilico del peptide precedentemente selezionato. Un peptide di questa nuova libreria ha dimostrato un'elevata potenza, permeabilità e stabilità, oltre a una biodisponibilità orale due volte superiore nei ratti rispetto al composto madre.

Conclusioni

Basandosi sulla formazione di un legame tioetere, i ricercatori sono riusciti a sviluppare una libreria che può essere rapidamente preparata e adattata per formare una serie di strutture peptidiche cicliche. I peptidi ciclizzati con tioetere possono essere ottimizzati con relativa facilità per migliorare la biodisponibilità orale. Poiché l'interesse per i peptidi ciclici è in continua crescita, questo e altri metodi di preparazione (librerie e screening) miglioreranno lo sviluppo di queste molecole.

 

Fonti

1. Merz, M.L. et al. (2023) “De novo development of small cyclic peptides that are orally bioavailable.” Nat. Chem. Bio. doi: 10.1038/s41589-023-01496-y
2. Ji, X., Nielsen, A.L., Heinis, C. (2023) “Cyclic Peptides for Drug Development.” Angew. Chem. Int. Ed. 63, e2023308251. doi: 10.1002/anie.202308251
3. Li, X., Craven, T.W., Levine, P.M. (2022) “Cyclic Peptide Screening Methods for Preclinical Drug Discovery.” J. Med. Chem. 65, 11913. doi: 10.1021/acs.jmedchem.2c01077

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