Quando i neuroni brillano: un nuovo modello per studiare il Parkinson 

Per migliorare la nostra comprensione delle malattie neurodegenerative sono necessari "sistemi modello" che riproducano fedelmente la biologia dei neuroni umani. Un recente studio di Gandy et al. pubblicato sull'International Journal of Molecular Sciences introduce una piattaforma innovativa basata sulla luminescenza per esplorare il ruolo dei geni associati alla malattia di Parkinson in cellule vive. Sfruttando le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e il tagging endogeno mediato da CRISPR, i ricercatori della Neuro (Montreal Neurological Institute-Hospital) hanno creato un sistema per studiare espressione e funzione proteica in un contesto fisiologicamente rilevante.

Si tratta di un lavoro dai risvolti esaltanti per il settore: l'utilizzo di modelli cellulari sempre più vicini alla realtà biologica e fisiologica del paziente. Se combinato con metodi di genome editing, questo approccio crea strumenti di ricerca che modellano meglio la biologia teorica, migliorando la trasposizione dei risultati alle malattie umane. Gli autori sembrano aver trovato una soluzione per il monitoraggio in tempo reale delle proteine legate al Parkinson, senza dover ricorrere a metodi di rilevamento basati su anticorpi.

iPSCs e tagging endogeno

Lo studio dei meccanismi delle malattie neurodegenerative richiede modelli rilevanti per l'uomo. I neuroni derivati dalle iPSC offrono un'opportunità senza precedenti per studiare le proteine associate alla malattia nel loro contesto nativo. L'obiettivo di questa ricerca è stato quello di costruire modelli iPSC per approfondire la conoscenza di geni associati alla malattia di Parkinson poco studiati, tra cui GBA1, LRRK2, SNCA e PRKN. Un modello che potesse superare l'ostacolo dato dalla limitata disponibilità di anticorpi altamente specifici e sufficientemente sensibili per rilevare i livelli di proteine endogene. I metodi tradizionali dipendono spesso dalla sovraespressione della proteina e ciò può influenzare i pathways cellulari, travisando i processi fisiologici e creando artefatti.

Per risolvere questo problema, lo studio ha impiegato il tagging endogeno basato su CRISPR con HiBiT, un piccolo tag peptidico di 11 aminoacidi. Il tag HiBiT consente di rilevare la luminescenza in modo sensibile e quantitativo se abbinato al suo partner di complementazione LgBiT, che può essere aggiunto ai lisati cellulari per l'analisi endpoint o espresso a livello intracellulare per approcci in cellule vive. Incorporando il tag HiBiT nei loci endogeni di questi geni associati al Parkinson, il team ha ridotto al minimo l'impatto sulla biologia cellulare nativa, creando al contempo strumenti di ricerca che possono essere utilizzati per studiare le caratteristiche delle proteine endogene con elevata sensibilità e precisione.

I ricercatori hanno poi integrato LgBiT in un locus safe-harbor delle iPSC, sotto il controllo di un promotore inducibile tramite doxiciclina. L'incorporazione di LgBiT intracellulare ha consentito sia la quantificazione in tempo reale in cellule vive sia l'imaging bioluminescente delle proteine marcate con HiBiT. Esprimendo LgBiT con un promotore inducibile, il segnale luminescente può essere attivato solo quando necessario, preservando i modelli di espressione della proteina nativa e consentendo al contempo un preciso controllo temporale sul rilevamento. Questo livello di rilevanza biologica rende questi modelli particolarmente preziosi per analizzare i meccanismi delle malattie e testare potenziali terapie.

Per i ricercatori che preferiscono un approccio non integrato, il nuovo ViaScript™ LgBiT mRNA Delivery System di Promega offre un metodo alternativo flessibile e transitorio per esprimere LgBiT intracellulare. Simile a un sistema di promotori inducibili, questo approccio consente di introdurre LgBiT e attivare l'analisi in vivo delle proteine marcate HiBiT proprio quando è necessario. Il metodo di trasfezione dell'mRNA, che garantisce un'espressione costante e regolabile di LgBiT, fornisce ai ricercatori uno strumento aggiuntivo per analizzare le dinamiche delle proteine marcate con HiBiT in modelli a cellule vive.

Applicazioni dello studio nella ricerca sul Parkinson

Questo studio è particolarmente interessante per la ricerca sulle malattie neurodegenerative perché si concentra sul Parkinson, una malattia caratterizzata dalla perdita progressiva di neuroni dopaminergici. Il team ha convalidato il sistema di luminescenza mediante il tagging HiBiT di GBA1, un gene legato sia al parkinson che alla malattia di Gaucher e attraverso il monitoraggio della sua attività in neuroni derivati da iPSC. È importante notare come il sistema sia stato convalidato utilizzando l'ambroxolo, uno chaperone farmacologico che aumenta i livelli dell'enzima GCase ed è noto per la sua capacità di aumentare i livelli di espressione di GBA1. Come previsto, il team ha osservato un aumento significativo del segnale luminescente dopo il trattamento dei neuroni GBA1-HiBiT.

Consentendo la quantificazione in tempo reale delle proteine associate al Parkinson nei neuroni umani, questa piattaforma può aiutare i ricercatori a esplorare i meccanismi della malattia, o persino a identificare nuovi candidati farmaci con una maggiore rilevanza fisiologica rispetto ai modelli tradizionali.

Open Biobank: un inno alla collaborazione

Oltre all'importanza dal punto di vista dell'innovazione scientifica, questa ricerca rappresenta anche un impegno per la ricerca scientifica in generale. Molte delle linee di iPSC generate in questo studio sono disponibili attraverso l'Open Biobank di The Neuro, accessibili quindi all'intera comunità scientifica. L'accesso aperto a modelli cellulari ben caratterizzati e biologicamente rilevanti accelera la scoperta, consentendo a più gruppi di ricerca di verificare le ipotesi, convalidare i risultati e sviluppare nuove strategie terapeutiche.

Conclusioni

Il lavoro di Gandy et al. mostra il potenziale dell'integrazione di strumenti molecolari all'avanguardia con la tecnologia iPSC, per sviluppare modelli biologicamente rilevanti di neurodegenerazione. Mentre gli studi di associazione genetica continuano a scoprire nuovi geni e proteine legati allo sviluppo del Parkinson, i ricercatori sono spesso frenati dalla mancanza di anticorpi validati e di alta qualità. Utilizzando il tagging HiBiT endogeno e la luminescenza inducibile, si può ora lavorare sulle proteine associate al Parkinson finora poco studiate. Il tutto in neuroni umani vivi, ottenendo una caratterizzazione precisa e dinamica della loro espressione e funzione.

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