IncRNA: da "DNA spazzatura" a protagonisti del genoma umano 

I lncRNA, noti come RNA lunghi non codificanti, sono per anni stati definiti come "DNA spazzatura", perché non ne si conosceva l'utilità. Diversi studi tuttavia hanno pian piano sgretolato questa definizione, attribuendo a queste porzioni di genoma umano funzioni biologiche e promuovendo il motto "La spazzatura non è spazzatura".

Scopriamo in questo articolo come si è arrivati a questo rovesciamento di prospettiva e quali sono le reali funzioni dei IncRNA.

Il Dogma di Crick e la nascita dell'espressione "DNA spazzatura"

Il 19 settembre 1957 Francis Crick tiene presso l'University College di Londra una conferenza dal titolo "Protein Synthesis". Nel suo discorso, Crick cita il suo collega James Watson affermando: "La cosa più significativa degli acidi nucleici è che non sappiamo cosa possano fare". Al contrario, secondo Crick le proteine svolgono invece un ruolo centrale e indispensabile come enzimi all'interno della cellula, in grado di catalizzare un'ampia gamma di reazioni chimiche. Crick è convinto che il ruolo principale del materiale genetico sia quello di controllare la sintesi delle proteine, sebbene il meccanismo di tale processo non è in quegli anni ancora noto.

L'ipotesi di Crick diviene uno dei dogmi della biologia molecolare, utilizzata per spiegare il flusso di informazioni tra DNA, RNA e proteine. Un risultato tanto più notevole se si considera che a quel tempo gli RNA messaggeri fossero praticamente sconosciuti, e che si sapesse ancora molto poco su come funzioni il meccanismo di traduzione cellulare per sintetizzare le proteine all'interno del citoplasma. Sebbene la successiva scoperta dei retrovirus, un gruppo di virus che utilizza la trascrittasi inversa per convertire il proprio genoma da RNA a DNA durante il proprio ciclo di replicazione virale, sembra mettere in crisi il dogma di Crick, non ha smontato la sua idea che le informazioni tra DNA e RNA fluiscano in entrambe le direzioni (2).

Il concetto di trasferimento delle informazioni spiegato da Crick ha indotto a paragonare il genoma a un codice informatico; una serie di istruzioni per l'assemblaggio delle proteine. I tentativi di sequenziare il genoma, culminati nel sequenziamento completo del genoma umano, hanno rivelato come meno del 2% di quest'ultimo sia costituito da geni codificanti proteine. Già negli anni '60 gli scienziati chiamano la stragrande maggioranza delle sequenze genomiche non codificanti "DNA spazzatura"(3); una serie di sequenze accumulate nel corso dell'evoluzione umana dalla ricombinazione del DNA, dai genomi di altre specie e persino da antichi virus.

Nel corso degli anni però la considerazione verso queste sequenze cambia; i rapidi progressi nel sequenziamento e nell'analisi dell'espressione genica portano a un progetto multidisciplinare per comprendere gli elementi funzionali del genoma umano: il progetto ENCODE, un consorzio di ricerca pubblico lanciato dall'Istituto di Ricerca Nazionale del Genoma Umano degli Stati Uniti nel settembre 2003. I risultati ottenuti sostengono come l'80% delle regioni genomiche non codificanti abbiano in realtà una funzione biochimica (4). Una scoperta che ha scatenato un acceso dibattito sulla vera natura del "DNA spazzatura".

"La spazzatura non è spazzatura", hanno scritto Palazzo e Koonin (5), concentrandosi su una classe di RNA noti come RNA lunghi non codificanti (lncRNA). I lncRNA vengono, in modo alquanto arbitrario, definiti come catene RNA più lunghe di 200 nucleotidi (nt) e non tradotte in proteine. La lunghezza di 200nt serve per distinguere i IncrRNA da altri tipi di RNA non codificanti più piccoli, come i microRNA (miRNA), gli small interfering RNA (siRNA) e i piccoli RNA nucleolari (snoRNA). Attualmente sono stati identificati quasi 18.000 lncRNA umani ed è stato provato come siano coinvolti in una serie di funzioni biologiche. Ulteriori ricerche hanno inoltre evidenziato alcune di queste funzioni e offerto un nuovo approccio allo sviluppo terapeutico basato sull'lncRNA. Andiamo a scoprirne alcune.

Il ruolo dei IncRNA nel glioma

Bi et al. hanno studiato il ruolo della traslocazione della variante 1 del plasmocitoma lncRNA (lnc-PVT1) nel glioma (6), che costituisce da solo oltre l'80% di tutti i tumori cerebrali maligni (7). Sebbene la trascrizione di lnc-PVT1 sia collegata a una ampia gamma di tumori (6), le reti di miRNA e mRNA con cui interagisce lnc-PVT1 nello specifico non sono ancora chiare. Bi et al. hanno cercato di definire il ruolo preciso di lnc-PVT1 nello sviluppo del glioma; basandosi su ricerche precedenti che mostravano il coinvolgimento nella patologia di miRNA, miR-1207-3p, il team si è concentrato sul meccanismo di interazione lncRNA-miRNA nel regolare il gene HNF-1B nel glioma. Dall'analisi di microarray e qPCR dei tessuti, oltre che delle linee cellulari del glioma, hanno determinato come la trascrizione di lncPVT-1 sia iper-regolata e svolga un ruolo importante nella proliferazione, migrazione, invasione e angiogenesi del tessuto tumorale. Utilizzando l'analisi bioinformatica, i ricercatori hanno inoltre saputo prevedere le reti regolatorie interessate dall'asse lncPVT-1/miR-1207-3p/HNF-1B. Previsioni confermate utilizzando il Dual-Luciferase® Reporter Assay System in esperimenti di cotrasfezione con vettori di espressione lncRNA-PVT1 e HNF1B, wild-type e mutanti. I risultati ottenuti suggeriscono come l'asse lncPVT-1/ miR-1207-3p/HNF-1B possa rappresentare un bersaglio per lo sviluppo di nuove e più efficaci terapie per combattere il glioma.

Gli inflammasomi nei disturbi polmonari

Gli inflammasomi sono complessi proteici intracellulari responsabili dell'attivazione delle risposte infiammatorie. L'inflammasoma NLRP3, ampiamente studiato, è implicato in una grossa varietà di malattie. Il danno acuto del polmone (ALI) e la sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS), associate al danno della barriera endoteliale, possono innescare l'attivazione di citochine infiammatorie attraverso l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 (8).

Sun et al. hanno studiato il ruolo di un miRNA e di un lncRNA nelle patologie ALI/ARDS (9). miR-223 era già stato dimostrato in grado di inibire l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nella coltura cellulare. Il lncRNA OIP5-AS1 promuove infiammazione e apoptosi nelle cellule provocando il danno delle cellule endoteliali (9). Lo studio ha mostrato come lncRNA OIP5-AS1 e miR-223 siano entrambi disregolati nel siero di pazienti affetti da ARDS/ALI, rispetto a donatori sani. Utilizzando un modello in vitro di ALI/ARDS in cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HPMEC) trattate con LPS, i ricercatori hanno dimostrato come i livelli di miR-223 siano diminuiti, mentre i livelli di OIP5-AS1 aumentati nelle cellule trattate. Dopo l'analisi bioinformatica, gli esperimenti eseguiti utilizzando il Dual-Luciferase® Reporter Assay System hanno confermato come il knockdown di OIP5-AS1 abbia promosso l'espressione di miR-223. Al contrario, la sovraespressione di OIP5-AS1 ha inibito l'espressione di miR-223, suggerendo come miR-223 sia un bersaglio diretto di OIP5-AS1. Ulteriori studi hanno infine dimostrato come la sovraespressione di miR-223 abbia promosso la proliferazione e inibito l'apoptosi, la piroptosi, la risposta infiammatoria e lo stress ossidativo delle HPMEC trattate con LPS. Pertanto, il knockdown di OIP5-AS1 e la sovraespressione di miR-223 potrebbero guidare approcci terapeutici al trattamento di ALI/ARDS.

I IncRNA nello sviluppo terapeutico

Lo sviluppo terapeutico con approccio diretto all'RNA ha guadagnato popolarità grazie alla facilità di sintesi e alla possibilità di scalarne la produzione, soprattutto rispetto alle tradizionali terapie eseguite con piccole molecole o anticorpi monoclonali. Gli attuali vaccini a mRNA, ormai molto diffusi, evidenziano i vantaggi di questo approccio. Sebbene gli oligonucleotidi antisenso siano l'approccio terapeutico più comune basato sull'RNA, l'attenzione recente è rivolta agli lncRNA (10). Tuttavia, le dimensioni relativamente grandi dei lncRNA rappresentano un ostacolo quando si tratta di farli arrivare a bersaglio nelle cellule. Un modo per aggirare questo ostacolo potrebbe essere identificando le regioni funzionali di una molecola di lncRNA e sintetizzando di conseguenza una porzione IncRNA più piccola.

Li et al. hanno utilizzato proprio questa strategia per studiare la fenilchetonuria (PKU), una rara malattia metabolica congenita, in un modello animale (11). La PKU è causata da più varianti del gene della fenilalanina idrossilasi (PAH), varianti che determinano un deficit di PAH. I ricercatori hanno scoperto come il lncRNA murino e l'HULC di lncRNA umano siano entrambi associati alla PAH. Inoltre, l'esaurimento di HULC ha portato a una ridotta attività enzimatica della PAH nelle cellule staminali pluripotenti indotte differenziate umane. Utilizzando IncRNA e HULC è sato possibile ridurre i livelli di fenilalanina in eccesso nel fegato e migliorare la tolleranza alla fenilalanina.

I risultati ottenuti da Li et al. hanno superato uno degli inconvenienti della terapia con lncRNA: la scarsa conservazione della sequenza tra lncRNA murini e umani, che rende difficile lo sviluppo di terapie in modelli animali che siano anche riutilizzabili sugli uomini. I IncRNA progettati per abbinare motivi funzionali di lncRNA conservati, come in questo studio, potrebbero rivelarsi una valida alternativa ad altre strategie terapeutiche basate sull'RNA.

In conclusione, sebbene la funzione di molti IncRNA rimanga ancora oggi sconosciuta, la ricerca futura sarà senz'altro in grado di spiegare il ruolo di queste molecole, dando sempre più credibilità alla considerazione per cui la spazzatura non sia, in realtà, spazzatura.

 

Riferimenti

 

1. Crick, F.H.C. (1958) On proteinsynthesis. Symp. Soc. Exp. Biol. 12, 138–163.

2. Crick, F. (1970) Central dogma of molecularbiology. Nature227, 561–563.

3. Palazzo, A.F. and Gregory, T.R. (2014) The case for junk DNA. PLoS Genet.10(5), e1004351.

4. The ENCODE Project Consortium. (2012) An integratedencyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature489, 57–74.

5. Palazzo, A.F. and Koonin, E.V. (2020) Functional long non-coding RNAs evolve from junk transcripts. Cell 183, 1151–1161.

6. Bi, Y. et al. (2021) LncRNA-PVT1 indicates a poorprognosis and promotesangiogenesis via activating the HNF1B/EMT axis in glioma. J. Cancer12(19), 5732–5744.

7. Goodenberger, M.L. and Jenkins, R.B. (2012) Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 205, 613–621.

8. Bos, L.D. et al. (2018) ARDS: challenges in patient care and frontiers in research. Eur. Respir. Rev. 27(147), 170107.

9. Ji, J. et al. (2021) LncRNA OIP5-AS1 knockdown or miR-223 overexpression can alleviate LPS-induced ALI/ARDS by interfering with miR-223/NLRP3-mediated pyroptosis. J. Gene Med. (Preprint ahead of publication) https://doi.org/10.1002/jgm.3385

10. Perry, R. B.-T. and Ulitsky, I. (2021) Therapy based on functional RNA elements. Science373(6555), 623–624.

11. Li, Y. et al. (2021) A noncoding RNA modulator potentiatesphenylalaninemetabolism in mice. Science373(6555), 662–673.

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