Accendi il cervello! Come marcare l'attività cerebrale con l'Imaging bioluminescente

L'imaging bioluminescente è una tecnica utilizzata per studiare in modo non invasivo l'effetto dei trattamenti medici su cellule e tessuti. La potenza del segnale luminescente e la possibilità di utilizzo in vivo consentono osservazioni ripetute nel tempo, e l'imaging in bioluminescenza può inoltre essere utilizzato in animali vivi senza interferire con i loro normali processi fisiologici.

Oltre all'imaging in bioluminescenza, anche quello in fluorescenza viene utilizzato negli studi cellulari. La fluorescenza però ha bisogno della luce per essere attivata, e ciò ne limita l'utilizzo in vivo a una profondità del tessuto o della cellula superiore a 1 mm.

Inoltre, l'autofluorescenza può essere un problema per l'imaging fluorescente, poiché componenti cellulari, proteine e cellule possono generare un segnale aspecifico una volta esposti alla luce. L'autofluorescenza può dare origine a "rumore di fondo" elevato, rendendo di conseguenza difficile distinguere il segnale di interesse dal contesto.

Poiché la luminescenza ha bisogno dell'enzima luciferasi e del suo substrato (la luciferina) per produrre luce, senza bisogno di immettere energia nel sistema, il suo segnale di fondo è trascurabile. Il rapporto tra un segnale elevato e un basso background si traduce in una maggiore sensibilità dell'imaging bioluminescente rispetto a quello fluorescente.

Da almeno vent'anni la bioluminescenza viene utilizzata per l'imaging in modelli animali di malattia. I tentativi di utilizzare la bioluminescenza per l'imaging dei tessuti cerebrali però si scontrano con l'ostacolo rappresentato dalla barriera emato-encefalica.

I limiti della luciferasi per gli studi sul cervello

La D-luciferina, substrato della firefly luciferasi, è una piccola molecola che in passato si pensava fosse permeabile alla barriera emato-encefalica. Tuttavia, studi recenti condotti con la somministrazione intraperitoneale di D-luciferina hanno mostrato un'emissione di segnale dai tessuti del cervello e del sistema nervoso centrale molto bassa (1).

NanoLuc® Luciferase è una delle alternative alla firefly luciferasi per gli studi in vivo ed è molto utilizzata in diverse aree della ricerca biomedica e della drug discovery sia come reporter, che come tag per la caratterizzazione delle proteine. Il substrato della luciferasi NanoLuc® è la furimazina e il suo l'analogo, la fluorofurimazina, è stato specificamente ottimizzato per la misurazione in vivo dell'attività di NanoLuc®. La fluorofurimazina esprime la sua massima luminosità utilizzata in vivo ed è inoltre solubile e biodisponibile. Per saperne di più sulle applicazioni in vivo della tecnologia NanoLuc® e sullo sviluppo della fluorofurimazina, leggete questo articolo.

Come si comporta, però, NanoLuc® nel cervello?

NanoLuc®: oltre la barriera emato-encefalica

In una recente pubblicazione sulla rivista Nature Chemical Biology, Su et al. riportano i risultati della valutazione e dell'ottimizzazione dei substrati NanoLuc® nell'imaging bioluminescente del cervello (1). Per lo studio sono stati utilizzati topi geneticamente modificati per esprimere la NanoLuc® Luciferasi fusa con tag fluorescenti (Antares) nel tessuto cerebrale. In questo modo sono stati selezionati e caratterizzati i substrati furimazina, idrofurimazina e fluorofurimazina, nonché gli analoghi strutturali di tutti questi substrati NanoLuc®.

Lo studio ha dimostrato come sia la fluorofurimazina che l'idrofurimazina abbiano ottenuto risultati inferiori nell'imaging cerebrale rispetto alla furimazina. Gli autori hanno quindi modificato la furimazina, rimuovendo i gruppi idrossi e amminici per creare nuovi derivati.

Questi sforzi hanno portato allo sviluppo della cefalofurimazina (CFz), con risultati davvero entusiasmanti. Su et al. scrivono che: "Tramite iniezione intra peritoneale di CFz in topi è stato possibile monitorare in vivo i neuroni, effettuando anche video di live imaging. Oltre a questo, abbiamo effettuato anche esperimenti di monitoraggio correlati al signaling del calcio, direttamente in animale."

Scopri i dettagli in questa breve video intervista del Dr. Thomas Kirkland, uno degli autori dell'articolo.

Il gruppo di ricerca non si è però fermato qui. In una pubblicazione per la rivista ACS Central Science, riportano di aver sviluppato un indicatore di bioluminescenza modulato da chinasi (KiMBI), un sensore in tempo reale per l'attività delle chinasi (2), e un secondo biosensore per misurare specificamente l'attivazione della via Ras-Raf-MEK-ERK. Esprimendo questa proteina nell'animale e somministrando il substrato CFz, i ricercatori sono riusciti a visualizzare in tempo reale l'inibizione della chinasi direttamente nel cervello. Sono stati così in grado di distinguere tra inibitori permeabili e inibitori impermeabili alla barriera emato-encefalica e di tracciare la farmacodinamica degli inibitori di MEK in modelli di cancro al cervello e controlli wild type, offrendo un nuovo ed entusiasmante approccio ai ricercatori che cercano di modulare l'attività delle chinasi nel cervello.

Con questo nuovo substrato, Su et al. sono stati in grado di tracciare l'attività cerebrale in topi vivi e, in definitiva, di migliorare la sensibilità dell'imaging cerebrale in bioluminescenza. Il CFz è un substrato eccellente per la luciferasi NanoLuc® e, se abbinato con costrutti reporter come il KiMBI, apre nuove possibilità per il campo delle neuroscienze.

Riferimenti:

1. Su, Y. et al. (2023) An optimized bioluminescent substrate for non-invasive imaging in the brain. Nature Chemical Biology. Published online February 2023. Accessed 21-March-2023.
2. Wu, Y. et al. (2023) Kinase-Modulated Bioluminescent Indicators Enable Noninvasive Imaging of Drug Activity in the Brain. ACS Central Science. Published online March 2023.

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