HaloTag: tracciare le cellule durante la morfogenesi

Le cellule, comunemente considerate la più piccola unità vitale, forniscono struttura e funzione a tutti gli esseri viventi (3). Ci sono organismi, chiamati unicellulari, in cui una singola cellula può essere considerata a tutti gli effetti l'organismo nella sua interezza (come nel caso del lievito, delle amebe o dei batteri). Altri, gli organismi pluricellulari, sono invece composti da una moltitudine di cellule. Il "sovraffollamento" di cellule le spinge, in questo tipo di organismi, ad acquisire e specializzarsi in diverse funzioni (3).

Le cellule che sviluppano specificità sono dette in fase di differenziamento, un termine che indica il passaggio di una cellula o di un tessuto da una forma primitiva o indifferenziata a una forma matura o differenziata. Il differenziamento permette alle cellule di organizzarsi in tessuti e organi all'interno di un organismo pluricellulare in via di sviluppo, secondo un processo chiamato "morfogenesi" (5).

La morfogenesi

La morfogenesi rimane ancora oggi un importante tema di discussione nella biologia dello sviluppo. Discussione che ruota attorno ad alcuni interrogativi fondamentali come (6):

• In che modo, le cellule in fase di differenziamento, si organizzano in tessuti e organi?
• Come viene gestita la crescita nel tempo e com'è possibile controllarla?
• Come fa un organismo a capire quando gli organi hanno forma e dimensione giusta?
• Come si orientano le cellule nella fase di migrazione?

Per rispondere a questi interrogativi gli scienziati devono prima riuscire a monitorare su piccola scala il movimento cellulare in real-time, per poter poi tracciare la "rotta" cellulare in maniera automatica anche su larga scala.

Recentemente, alcuni studi hanno scandagliato diverse tecniche per tracciare le cellule, incluso l'uso di marcatura cellulare tramite la tecnologia HaloTag® durante lo sviluppo di tessuti di Drosophila, con l'obiettivo di tracciare il comportamento di un sottoinsieme di cellule nel tempo.

L'utilità HaloTag nel tracciamento cellulare

Ad oggi, la microscopia e l'analisi delle immagini della formazione dei tessuti negli embrioni di topo hanno ottenuto diversi successi. Ciò ha consentito la generazione di mappe dinamiche del destino delle cellule e la capacità di esaminare quantitativamente la divisione cellulare e il comportamento durante la formazione del tubo neurale nell'embrione di topo. Tuttavia, la microscopia ottica ha i suoi limiti, specialmente nelle regioni anatomiche dove la mancanza di trasparenza e le difficili proprietà ottiche rendono l'imaging impegnativo (4).

Gli scienziati che si occupano del tracciamento cellulare durante lo sviluppo della Drosophila utilizzano le proteine HaloTag, che hanno la capacità di legare in modo covalente un ligando sintetico permeabile alle cellule per generare tag fluorescenti (1). In questo studio, in cui sono stati utilizzati alcuni espianti del disco immaginale dell'occhio di Drosophila, l'espressione condizionale della proteina HaloTag7, nlsHalo, è stata ottenuta attraverso la ricombinazione specifica del sito FLP/FRT e l'aggiunta di shock termico.

Lo studio ha rilevato come un breve shock termico sia sufficiente a far ricombinare il 10-30% delle cellule ed esprimere nlsHalo, con fluorescenza dopo l'aggiunta del ligando osservata a circa 45-60 minuti e ricombinazione rilevata fino a 7-8 ore dopo (1). Questa fluorescenza rapida e prolungata era stata anticipata, poiché il segnale di HaloTag ha un elevato rapporto segnale-rumore e può essere per questo facilmente fuso con una proteina di interesse, consentendole di produrre un segnale più rapido, più forte e più stabile rispetto al rosso o all'infrarosso delle comuni proteine fluorescenti. In queste condizioni, il tagging HaloTag ha consentito 6-8 ore di imaging, permettendo di tracciare il path cellulare nei dischi immaginali dell'occhio di Drosophila (1).

Un'ultima caratteristica che rende il tag HaloTag uno strumento particolarmente utile per questo tipo di analisi è la sua capacità di regolare la frequenza di ricombinazione per la marcatura delle celle regolando i parametri dello shock termico. Ciò è particolarmente vantaggioso nei tessuti complessi da marcare, specialmente nei sistemi in cui le cellule si muovono rapidamente (1).

Nel complesso, lo studio appena esaminato fornisce uno standard per il monitoraggio futuro delle cellule, così come per l'analisi quantitativa in real-time del movimento cellulare.

Fonti

• Couturier, L et al. (2022) HaloTag-based reporters for sparse labeling and cell tracking. Fly. 16(1), 360-366.
• Davis, M. W. et al. (2008). Gene activation using FLP recombinase in C. elegans. PLoS Genetics. 4(3)
• Ellinger, I., & Ellinger, A. (2014). Smallest unit of life: Cell biology. Comparative Medicine. (pp. 19-33)
• McDole, K. et al. (2018). In Toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175(3), 859-876.e33.
• Sunderland, M. (2008). Morphogenesis. The Embryo Project Encyclopedia. Retrieved April 12, 2023.
• Saunders, T. E., & Ingham, P. W. (2019). Open Questions: how to get developmental biology into shape? BMC Biology. 17(1), 17.

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